鉴定应激响应性mRNA异构体UFD1s
寻找哺乳动物细胞中受应激调控且保守的SR-mRNAiso。
对HEK293T和N2a细胞进行葡萄糖剥夺（GD）或毒胡萝卜素（TG）处理，进行rRNA去除的RNA-seq，鉴定差异剪接事件并进行人鼠保守性分析；用RT-PCR和smFISH验证UFD1s表达和定位。
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编码微蛋白的UFD1变体通过调节UFD1f和IPMK泛素化在抗应激反应中发挥关键作用
A UFD1 variant encoding a microprotein modulates UFD1f and IPMK ubiquitination to play pivotal roles in anti-stress responses.
实验完整度
高涵盖细胞系、原代肝细胞、Ufd1s−/−小鼠及NASH模型，并行泛素化组学、IP-MS和功能验证
主要模型
HEK293T和N2a细胞系 UFD1s MUT（A5SS突变）细胞 Ufd1s−/−小鼠 MCD饮食诱导的NASH小鼠模型 人非NASH和NASH肝组织标本
重点核对
UFD1s MUT细胞中UFD1s mRNA和蛋白水平降低而UFD1f不变 UFD1s缺失增加UFD1f的K63连接泛素化但不影响K48、K11、K6连接 UFD1s与UFD1f竞争结合MARCH7，MARCH7敲低降低UFD1f总泛素化和K63泛素化 IPMK是UFD1s缺失细胞中泛素化变化最显著的蛋白，其K11和K48泛素化比例改变 Ufd1s−/−小鼠肝脏Ipmk蛋白升高、LC3降低、脂滴增多，NASH进展加速
摘要
真核细胞采取多种机制应对内外应激，包括代谢反应和应激响应性mRNA异构体（SR-mRNAiso）的产生，如经典的XBP1s。本文鉴定了一个哺乳动物保守的SR-mRNAiso——UFD1s，其编码具有抗应激功能的微蛋白。UFD1s通过与E3泛素连接酶MARCH7竞争性结合，降低UFD1全长蛋白（UFD1f）的K63连接泛素化水平，从而调节蛋白泛素化动态。肌醇多磷酸多激酶（IPMK）被鉴定为在K48和K11泛素化变化方面受UFD1s调控最显著的靶标。UFD1s促进自噬和脂肪酸氧化，而IPMK则持续被去稳定化。Ufd1s缺陷的雄性小鼠表现出代谢紊乱并加速NASH进展。表达UFD1s的质粒或circRNA可缓解小鼠NASH，表明UFD1s具有治疗价值。我们的发现揭示了一个哺乳动物保守的微蛋白，通过调节泛素化和代谢在抗应激调控中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UFD1s是否作为应激响应性微蛋白在抗应激反应中发挥作用，以及其分子机制和生理功能为何。
- 核心机制
- UFD1s通过竞争性结合E3泛素连接酶MARCH7，降低UFD1f的K63连接泛素化，进而改变IPMK的K48/K11泛素化比例使其去稳定化，从而抑制AMPK激活并促进自噬和脂肪酸氧化。
- 主要证据
- 在HEK293T、N2a等细胞中通过CRISPR/Cas9构建UFD1s MUT细胞，结合RNA-seq、泛素化修饰蛋白质组、IP-MS、Co-IP和Western blot验证泛素化链类型和位点；在Ufd1s−/−小鼠中验证代谢和NASH表型；在NASH小鼠中通过质粒或circRNA过表达UFD1s验证治疗效应。
- 研究意义
- 揭示了一个哺乳动物保守的微蛋白在抗应激调控中的关键作用，并提示UFD1s具有治疗NASH的潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证UFD1s编码微蛋白
确认UFD1s mRNA是否翻译为独立微蛋白。
构建UFD1s-Flag融合表达质粒，将起始密码子ATG突变为ATT；制备抗UFD1s特异性抗体；用Western blot、免疫荧光和免疫沉淀-质谱验证内源UFD1s蛋白表达和定位。
构建UFD1s缺陷细胞并验证抗应激表型
评估UFD1s缺失对细胞应激耐受和代谢的影响。
用CRISPR/Cas9改变UFD1的A5SS（AGGTCA→CGCAGC）构建UFD1s MUT HEK293T和N2a细胞；检测ROS、ATP、细胞存活、线粒体呼吸（OCR）、自噬和脂滴。
解析UFD1s对UFD1f泛素化的调控机制
确定UFD1s是否以及如何调节UFD1f的泛素化链类型。
在WT和UFD1s MUT细胞中免疫沉淀UFD1f，用总泛素、K48、K11、K63和K6泛素抗体检测；通过IP-MS寻找共同E3连接酶；Co-IP验证UFD1f与MARCH7互作；shRNA敲低MARCH7；Re-IP结合MS鉴定K63泛素化位点并构建K240R/K280R突变体。
鉴定UFD1s调控的下游泛素化靶标IPMK
在全蛋白质组水平寻找UFD1s调控的关键泛素化靶标。
对WT和UFD1s MUT HEK293T细胞进行泛素化修饰蛋白质组分析（K-ε-GG IP-MS）；验证IPMK的蛋白水平、泛素化链类型和翻译；检测UFD1f与IPMK互作及MARCH7敲低对IPMK的影响。
验证IPMK在UFD1s表型中的作用
确认IPMK是否介导UFD1s对自噬和脂代谢的调控。
在WT和UFD1s MUT细胞中shRNA敲低IPMK，检测LC3斑点、Nile red脂滴和FAO（OCR）；检测AMPK磷酸化及PPARα、PGC-1α水平。
构建Ufd1s−/−小鼠并分析代谢表型
在体内验证Ufd1s的生理功能和抗应激作用。
用CRISPR/Cas9改变Ufd1 A5SS构建Ufd1s−/−小鼠；检测能量代谢、肝脏形态、Ipmk蛋白、LC3和脂滴；分离原代肝细胞检测ROS、ATP和FAO。
评估Ufd1s对NASH的治疗潜力
测试过表达Ufd1s能否缓解小鼠NASH。
在MCD饮食诱导的NASH小鼠中，通过尾静脉高压注射pLIVE-Ufd1s质粒或注射Lipofectamine 3000包裹的circUfd1s；检测血清TG、总胆固醇、AST、ALT及肝脏组织学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
鉴定应激响应性RNA异构体
解析泛素化修饰机制
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11966025 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 应激处理 | 毒胡萝卜素 | Sigma | T9033 |
| 衣霉素 | Sigma | T7765 | |
| 氯喹 | Sigma | C6628 | |
| NMDI14 | MCE | HY-111374 | |
| 泛素化检测 | MG132 | APExBIO | A2585 |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗β-ACTIN抗体 | TransGen | HC201 | |
| 抗UFD1f抗体 | Proteintech | 10615-1-AP | |
| 抗总泛素抗体 | CST | 3936 | |
| 抗K48泛素抗体 | CST | 8081 | |
| 抗K63泛素抗体 | CST | 5621 | |
| 抗K11泛素抗体 | Invitrogen | PA5-120621 | |
| 抗K6泛素抗体 | Abclonal | A18106 | |
| 抗MARCH7抗体 | Santa Cruz | sc-166945 | |
| 抗IPMK抗体 | Immunoway | YT2384 | |
| 抗LC3抗体 | Proteintech | 14600-1-AP | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | CST | 2535 | |
| 抗AMPK抗体 | CST | 5832 | |
| 抗PGC-1α抗体 | Abclonal | A20995 | |
| 抗PPARα抗体 | Immunoway | YM8234 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma | F6057 |
| 自噬检测 | 尼罗红 | Sigma | 72485 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | |
| 细胞存活检测 | 碘化丙啶 | Beyotime | ST511 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033 |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| Seahorse OCR检测 | 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- | |
| 泛素化修饰蛋白质组 | PTMScan泛素残基基序（K-ε-GG）试剂盒 | CST | 5562 |
| 质谱分析 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- |
| 小鼠基因型鉴定 | mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA转录试剂盒 | Invitrogen | AM1345 |
| MEGAshortscriptTM T7转录试剂盒 | Invitrogen | AM1354 | |
| MEGAclearTM转录纯化试剂盒 | Invitrogen | AM1908 | |
| 质粒构建 | p3×FLAG-Myc-CMV24载体 | Sigma | E9283 |
| pKH3载体 | Sigma | 12555 | |
| pLIVE载体 | Mirus Bio | MIR 5420 | |
| CRISPR/Cas9 | px330-mCherry载体 | Addgene | 98750 |
| pcDNA3载体 | Invitrogen | V79020 | |
| circRNA合成 | TranscriptAid T7高产率转录试剂盒 | Thermo | K0441 |
| RNase R | Epicenter | RNR07250 | |
| 组织学染色 | H&E染料 | Servicebio | G1003 |
| Masson染色液 | Servicebio | G1006 | |
| 油红O染液 | Servicebio | G1015 | |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Servicebio | G1212 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 应激处理与RNA鉴定 | TG浓度300 nM、处理时间6 h（RNA）或12 h（蛋白）；GD处理24 h；RNA-seq测序深度和差异剪接阈值（fold change >2或<0.5，P<0.05） 阅读提示：Methods“Cellular stress, cycloheximide (CHX), and NMDI14 treatments”和“Stress responsive mRNA isoform (SR-mRNAiso) identification”小节；Fig. 1b图注 |
| UFD1s MUT细胞构建 | sgRNA序列5′-TGCTAGCAGGGCCTAATGAC-3′；A5SS突变AGGTCA→CGCAGC；单克隆筛选和Sanger测序验证 阅读提示：Methods“CRISPR/Cas9-mediated UFD1s MUT cells”小节；Fig. 2a图注 |
| 泛素化链检测 | MG132 25 μM处理6 h；IP抗体用量3 μg；K48、K11、K63、K6泛素抗体稀释比例；Re-IP两次IP顺序 阅读提示：Methods“Examination of protein ubiquitination”和“Two-step immunoprecipitation assay (Re-IP)”小节；Fig. 3a–d、3h图注 |
| Ufd1s−/−小鼠构建与NASH模型 | 小鼠性别和周龄（雄性9周龄）；MCD饮食4周；24 h饥饿方案；每组小鼠数量（N=3或N=6） 阅读提示：Methods“Mice”和“NASH model”小节；Fig. 6e、7a图注 |
| Ufd1s过表达治疗 | pLIVE-Ufd1s 15 μg尾静脉高压注射一次；circUfd1s 10 μg与20 μL Lipofectamine 3000尾静脉注射两次；circUfd1sATG-ATT对照 阅读提示：Methods“Hydrodynamic injection of plasmid DNA”和“CircRNA administration in mice”小节；Fig. 7a图注 |