建立肺特异性FOXN3敲除和过表达小鼠模型并诱导肺纤维化
验证FOXN3在体内对肺纤维化的调控作用。
使用Foxn3fl/fl小鼠气管内给予Cre腺病毒实现肺特异性敲除，使用Foxn3LSL KI小鼠给予Cre腺病毒实现肺特异性过表达，随后用BLM诱导肺纤维化，检测纤维化表型、炎症和胶原含量。
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NEK6磷酸化FOXN3通过Smad信号促进肺纤维化
Phosphorylation of FOXN3 by NEK6 promotes pulmonary fibrosis through Smad signaling.
实验完整度
高包含条件性敲除/过表达/点突变敲入小鼠模型、多种细胞模型、临床样本及多种分子机制验证
主要模型
Foxn3fl/fl小鼠（肺特异性敲除） Foxn3LSL KI小鼠（肺特异性过表达） Foxn3KI/KI小鼠（S379/383A突变敲入） A549细胞、原代ATII细胞、原代肺成纤维细胞 临床肺纤维化患者肺组织样本（n=20）
重点核对
BLM诱导肺纤维化模型：1.5 mg/kg BLM气管内滴注，3天后给予5×10^8 PFU Cre腺病毒，3周后取材 TGF-β处理条件：10 ng/ml，16小时，处理前用0.05% FBS饥饿8小时 FOXN3敲低/过表达验证：siRNA或慢病毒介导，48小时后收集细胞 Smad4泛素化与降解检测：MG-132（20 μM，2-4小时）处理，CHX半衰期实验 临床样本：20例肺纤维化患者病变区及癌旁正常区，免疫组化评分（IRS）
摘要
转录抑制因子FOXN3在调节肺部炎症反应中起关键作用，而肺部炎症反应对肺纤维化的发生至关重要。然而，FOXN3在肺纤维化中的具体调控功能尚不清楚。在此，我们展示FOXN3通过抑制Smad转录活性来抑制肺纤维化。FOXN3靶向大量Smad应答基因启动子，促进Smad4泛素化，从而破坏Smad2/3/4复合物与染色质的结合并消除其转录应答。在促纤维化刺激下，NEK6在S412和S416位点磷酸化FOXN3，导致其降解。FOXN3的缺失抑制β-TrCP介导的Smad4泛素化，稳定Smad复合物与其应答元件的结合并促进转录激活，从而促进肺纤维化的发生。值得注意的是，我们在临床肺纤维化病例中发现FOXN3与Smad4之间呈显著的反向表达模式，强调了NEK6-FOXN3-Smad轴在肺纤维化病理过程中的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FOXN3在肺纤维化中的具体调控功能及其分子机制尚不清楚，本研究旨在阐明FOXN3如何调控肺纤维化以及上游激酶对其的调控机制。
- 核心机制
- FOXN3通过促进β-TrCP介导的Smad4泛素化，破坏Smad2/3/4复合物与染色质的结合，抑制Smad转录活性；促纤维化刺激下NEK6磷酸化FOXN3的S412和S416位点，导致其β-TrCP介导的降解，从而解除对Smad4泛素化的促进，稳定Smad复合物与染色质结合并激活Smad转录，促进肺纤维化。
- 主要证据
- 肺特异性FOXN3敲除小鼠加重BLM诱导的肺纤维化和炎症，FOXN3过表达小鼠减轻纤维化；A549细胞和原代肺成纤维细胞中FOXN3调控EMT标志物和促纤维化因子；CUT&Tag显示FOXN3和Smad4共同靶向大量基因启动子；ChIP和分步分离实验证明FOXN3促进Smad4泛素化并破坏Smad复合物与染色质结合；NEK6体外激酶实验和点突变小鼠（S379/383A）验证磷酸化依赖的FOXN3降解；临床样本显示FOXN3与Smad4蛋白表达呈负相关。
- 研究意义
- 揭示了NEK6-FOXN3-Smad轴在肺纤维化病理过程中的重要性，为肺纤维化的治疗提供了潜在的分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FOXN3对上皮-间质转化（EMT）的调控
探究FOXN3是否通过调控EMT影响肺纤维化。
在A549细胞中过表达或敲低FOXN3，进行侵袭、迁移和伤口愈合实验，检测间质标志物（Vimentin、N-Cadherin）和上皮标志物（E-Cadherin）的表达；在Foxn3LSL KI小鼠原代肺成纤维细胞中验证。
阐明FOXN3抑制Smad转录活性的分子机制
确定FOXN3是否通过调控Smad4稳定性及Smad复合物与染色质结合来抑制Smad转录。
通过转录组测序、ChIP、CUT&Tag、分步分离、泛素化实验、Co-IP等检测FOXN3对Smad4泛素化、降解及Smad复合物染色质结合的影响。
鉴定NEK6对FOXN3的磷酸化及降解调控
确定上游激酶NEK6磷酸化FOXN3的位点及其对FOXN3降解和Smad信号的影响。
通过Scansite预测、体外激酶实验、点突变、泛素化实验、Co-IP等验证NEK6磷酸化FOXN3 S412/S416，促进β-TrCP介导的FOXN3泛素化和降解，进而激活Smad信号。
构建FOXN3 S379/383A敲入小鼠验证磷酸化位点的体内功能
在体内验证FOXN3 S412/416（小鼠S379/383）磷酸化对肺纤维化的影响。
构建Foxn3KI/KI小鼠（S379A和S383A双突变），BLM诱导肺纤维化，检测纤维化表型、炎症、胶原含量及Smad4表达。
分析临床肺纤维化样本中FOXN3与Smad4的表达相关性
验证FOXN3-Smad轴在临床肺纤维化中的相关性。
对20例肺纤维化患者病变区和邻近正常区进行免疫组化检测FOXN3和Smad4蛋白表达，并进行IRS评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基/F12 | -- | -- | |
| F-12K培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Millipore | -- | |
| Western blot | 抗hnRNPU抗体 | Proteintech | 14599-1-AP |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| 抗N-Cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 抗E-Cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗Smad4抗体 | Proteintech | 10231-1-AP | |
| 抗FOXN3抗体 | Proteintech | 25399-1-AP | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗β-TrCP抗体 | Cell Signaling Technology | 4394 | |
| 抗Smad4抗体 | Cell Signaling Technology | 46535 | |
| 抗FOXN3抗体 | Abcam | ab129453 | |
| 抗磷酸化Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828 | |
| 抗Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8685 | |
| 抗NEK6抗体 | Santa Cruz | sc-374491 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗磷酸化FOXN3 S412/416抗体 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗FOXN3抗体 | Abcam | ab129453 |
| 抗Smad4抗体 | AiFang biological | AF300076 | |
| 抗磷酸化FOXN3 S412/416抗体 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Smad4抗体 | Proteintech | 10231-1-AP |
| 抗FOXN3抗体 | Abcam | ab129453 | |
| 抗兔IgG抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| CUT&Tag | 抗Smad4抗体 | Proteintech | 10231-1-AP |
| 抗FOXN3抗体 | Abcam | ab129453 | |
| ChIP-qPCR | 抗Smad2抗体 | Proteintech | 12570-1-AP |
| 抗Smad3抗体 | Proteintech | 66516-1-Ig | |
| 抗Smad4抗体 | Proteintech | 10231-1-AP | |
| 抗FOXN3抗体 | Abcam | ab129453 | |
| 免疫沉淀 | 抗DYKDDDDK磁珠 | Thermo Fisher Scientific | A36798 |
| 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88836 | |
| 药物处理 | MG132 | MedChemExpress | HY-13259 |
| 转化生长因子β | MedChemExpress | HY-P70543 | |
| 羟脯氨酸测定 | 羟脯氨酸比色测定试剂盒 | Sigma | -- |
| ELISA | TNFα ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 逆转录 | 5× All-In-One逆转录试剂盒 | Applied Biological Materials | G486 |
| 实时定量PCR | EvaGreen qPCR预混液 | Applied Biological Materials | G891 |
| CUT&Tag | NovoNGS® CUT&Tag高灵敏度试剂盒 | -- | -- |
| 腺病毒 delivery | 编码Cre重组酶的腺病毒 | OBIO | -- |
| siRNA knockdown | NEK6 siRNA #1 | RIBOBIO | siG000010783A-1-5 |
| NEK6 siRNA #2 | RIBOBIO | siG000010783B-1-5 | |
| NEK6 siRNA #3 | RIBOBIO | siB161216031201-1-5 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BLM诱导肺纤维化模型与腺病毒递送 | BLM剂量（1.5 mg/kg）、给药途径（气管内滴注）、腺病毒剂量（5×10^8 PFU/只）及给药时间（BLM后3天）、取材时间（腺病毒后3周） 阅读提示：Methods中“BLM-induced fibrosis model and adenovirus delivery”小节 |
| TGF-β处理细胞 | TGF-β浓度（10 ng/ml）、处理时间（16小时）、血清饥饿条件（0.05% FBS，8小时） 阅读提示：Figure legends中图3d、3f-i、4c、5i、5k、8g-l等 |
| FOXN3敲低/过表达 | siRNA序列、shRNA序列、慢病毒感染后收集时间（48小时） 阅读提示：Methods中“RNAi knockdown”和“Lentivirus and adenovirus”小节 |
| 泛素化与降解实验 | MG-132浓度（20 μM）和处理时间（2-4小时）、CHX处理条件 阅读提示：Figure legends中图4d-h、5k、6d-i、8c-d等及Supplementary Fig. 3a |
| 临床样本分析 | 样本量（n=20）、病变区与邻近正常区的定义、免疫组化抗体稀释度（FOXN3 1:200，Smad4 1:200） 阅读提示：Methods中“Patient samples”小节及图9 legend |