HFD对下丘脑SEL1L-HRD1 ERAD表达的调控
探究高脂饮食是否调节ARC区域SEL1L-HRD1 ERAD的表达
将POMC-eGFP转基因小鼠置于60% HFD喂养1周或8周，用qPCR、Western blot和免疫荧光检测ARC区域SEL1L和HRD1的mRNA和蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SEL1L-HRD1内质网相关降解在POMC表达神经元中调控瘦素信号和饮食诱导的肥胖
Regulation of leptin signaling and diet-induced obesity by SEL1L-HRD1 ER-associated degradation in POMC expressing neurons.
实验完整度
高包含POMC特异性Sel1L敲除小鼠体内模型和HEK293T细胞体外模型；通过代谢表型、瘦素敏感性、parabiosis、pSTAT3信号、LepRb降解和聚集等实验验证功能和机制。
主要模型
POMC特异性Sel1L敲除小鼠（Sel1LPOMC） HEK293T细胞（HRD1−/−和野生型）
重点核对
Sel1LPOMC小鼠在5周龄起喂食60% HFD 8周，监测体重、体成分、GTT和ITT 瘦素敏感性测试：12周龄HFD雄性小鼠每日腹腔注射PBS或瘦素（2 mg/kg体重）3天 Parabiosis实验：7周龄雌性小鼠配对后恢复2周，HFD 8周 pSTAT3免疫荧光和Western blot：禁食过夜后腹腔注射瘦素（2 mg/kg体重） HEK293T细胞转染mLepRb-3xFlag，瘦素（100 nM）处理30分钟检测pJAK2和pSTAT3
摘要
下丘脑内质网（ER）稳态与饮食诱导的肥胖（DIO）和2型糖尿病的发病机制有关；然而，潜在的分子机制仍不清楚且有争议。在此，我们报道高度保守的ER相关蛋白降解（ERAD）机器中的SEL1L-HRD1蛋白复合物在表达POMC的神经元中改善饮食诱导的肥胖及其相关并发症，部分通过调节瘦素受体长亚型（LepRb）的周转。在表达POMC的神经元中缺失SEL1L会减弱瘦素信号，并使小鼠易患HFD相关病理，包括脂肪肝、葡萄糖不耐受、胰岛素和瘦素抵抗。机制上，新生LepRb，无论是野生型还是疾病相关的Cys604Ser变体，都易于错误折叠，并且是SEL1L-HRD1 ERAD的真正底物。在缺乏SEL1L-HRD1 ERAD的情况下，LepRb主要滞留在ER中，且不依赖于ER应激。本研究揭示了SEL1L-HRD1 ERAD在中枢瘦素抵抗和瘦素信号发病机制中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 表达POMC的神经元中SEL1L-HRD1 ERAD在饮食诱导的肥胖和瘦素信号中是否发挥作用及其机制是什么？
- 核心机制
- SEL1L-HRD1 ERAD降解错误折叠的新生LepRb，促进功能性LepRb到达细胞表面；缺失该通路导致LepRb滞留在ER并形成聚集体，从而减弱瘦素信号。
- 主要证据
- Sel1LPOMC小鼠在HFD下表现出加重的肥胖、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和瘦素抵抗；POMC神经元中pSTAT3信号受损；HEK293T细胞中HRD1缺失导致LepRb稳定、表面减少和聚集增加。
- 研究意义
- 揭示了SEL1L-HRD1 ERAD在中枢瘦素抵抗和瘦素信号中的重要作用，并提示人LepRb C604S变体是ERAD底物，与严重肥胖相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
POMC特异性ERAD缺陷对DIO表型的影响
确定POMC神经元中SEL1L缺失是否影响饮食诱导的肥胖及其病理
Sel1LPOMC小鼠和对照Sel1Lf/f小鼠从5周龄起喂食HFD或普通饲料8周，监测体重、体成分、组织学、葡萄糖耐量和胰岛素耐量。
ERAD缺陷对摄食和瘦素敏感性的影响
探究Sel1LPOMC小鼠DIO易感性的机制是否涉及摄食增加和瘦素抵抗
测量每日摄食量，进行配对喂食实验，并通过每日腹腔注射瘦素（2 mg/kg）3天评估瘦素敏感性，监测体重和摄食。
Parabiosis验证循环因子介导的瘦素抵抗
确定Sel1LPOMC小鼠的肥胖是否由循环因子（如瘦素）介导
将7周龄雌性小鼠进行parabiosis手术，恢复2周后HFD喂养8周，监测体重、体成分和血清激素。
ERAD缺陷对瘦素-pSTAT3信号的影响
检测POMC神经元中SEL1L缺失是否损害瘦素诱导的STAT3磷酸化
在Sel1LPOMC;POMC-eGFP小鼠中，禁食过夜后腹腔注射瘦素（2 mg/kg），通过免疫荧光和Western blot检测ARC区域pSTAT3。
ERAD缺陷与UPR和炎症的关联
探究ERAD缺失是否激活UPR或炎症，以及这些过程是否介导瘦素抵抗
在Sel1LPOMC小鼠ARC区域检测PERK、IRE1α、Xbp1剪接、BiP等UPR标志物，以及JNK、IκBα、GFAP、IBA1等炎症标志物；在HEK293T细胞中用thapsigargin诱导ER应激并检测瘦素信号。
LepRb作为SEL1L-HRD1 ERAD底物的验证
确定LepRb是否是SEL1L-HRD1 ERAD的生理底物及其降解机制
在HRD1−/−和WT HEK293T细胞中转染mLepRb-3xFlag，检测LepRb蛋白稳定性、泛素化、与SEL1L相互作用、EndoH敏感性、表面生物素化、免疫荧光定位和聚集形成。
人LepRb C604S变体的ERAD底物验证
检验疾病相关LepRb C604S变体是否也是SEL1L-HRD1 ERAD底物
在HEK293T细胞中表达C602S mLepRb（对应人C604S），检测瘦素诱导的pSTAT3、蛋白稳定性和HMW聚集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | POMC-Cre小鼠品系 | JAX | 010714 |
| Pomc-eGFP报告小鼠 | JAX | 009593 | |
| 普通饲料 | PicoLab | 5L0D | |
| 高脂饲料 | Research Diet | D12492 | |
| 瘦素处理 | 瘦素 | R&D systems | 498-OB-05M |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂 | Sigma | P8340 |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma | P5726 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Thermo Scientific | 23030 | |
| Bradford测定 | Bio-Rad | 5000006 | |
| Phos-tag试剂 | NARD Institute | AAL-107 | |
| λ磷酸酶 | New England BioLabs | P0753S | |
| PMP缓冲液 | New England BioLabs | B0761S | |
| PVDF膜（0.45 μm） | Millipore | IPFL00010 | |
| SEL1L抗体（兔，1:8000） | Abclonal | E112049 | |
| HRD1抗体（兔，1:2000） | ABclonal | E15102 | |
| GRP78 BiP抗体（兔，1:5000） | Abcam | ab21685 | |
| HSP90抗体（兔，1:5000） | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-7947 | |
| HSP70抗体（兔，1:1000） | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-1060 | |
| FLAG抗体（鼠，1:2000） | Sigma-Aldrich | F-1804 | |
| IRE1α抗体（兔，1:2000） | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| p-eIF2α抗体（兔，1:2000） | Cell Signaling Technology | 3597 | |
| eIF2α抗体（兔，1:2000） | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| p-JNK抗体（鼠，1:2000） | Cell Signaling Technology | 9255 | |
| JNK抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| PERK抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 3192 | |
| pSTAT3 (Tyr705)抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 9131 | |
| STAT3抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 9132 | |
| pJAK2 (Tyr1007/1008)抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 3771 | |
| JAK2抗体（兔，1:1000） | ABclonal | A19629 | |
| Tubulin抗体（鼠，1:5000） | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5286 | |
| IκBα抗体（兔，1:1000） | Cell Signaling Technology | 9242 | |
| IBA1抗体（兔，1:1000） | Proteintech | 10904-1-AP | |
| 免疫荧光 | α-MSH抗体（羊，1:2000） | Millipore | AB5087 |
| β-内啡肽抗体（兔，1:2000） | Phoenix Pharmaceuticals | H-022-33 | |
| GFP抗体（鸡IgY，1:300） | Abcam | ab13970 | |
| p-Y705 STAT3抗体（兔，1:200） | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| GFAP抗体（兔，1:500） | Agilent | Z033429-2 | |
| FLAG抗体（鼠，1:500） | Sigma-Aldrich | F-1804 | |
| KDEL抗体（兔，1:500） | Novus Biologicals | NBP2-75549 | |
| eIF3η抗体（羊，1:500） | Santa Cruz Biotechnology | sc-16377 | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 抗羊IgG Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 抗羊IgG Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 抗羊IgG Cy5 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 驴抗鼠IgG Alexa flour 555 | Invitrogen | A32773 | |
| 山羊抗鸡IgY FITC | Aves Labs | F-1005 | |
| 含DAPI的封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 明胶包被载玻片 | Southern Biotech | SLD01-CS | |
| Fisherfinest优质盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5 P | |
| Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片 | Millipore | PEZGS0816 | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Advanced Biomatrix | 5048 | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | FB12999102 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma | -- |
| 质粒构建 | p3xFLAG-CMV14载体 | -- | -- |
| PFU DNA聚合酶 | Agilent | 600140 | |
| CRISPR/Cas9敲除 | lentiCRISPR v2质粒 | Addgene | 52961 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HFD喂养模型 | 小鼠品系（C57BL/6J背景）、性别（雌雄）、起始年龄（5周龄）、HFD成分（60%脂肪）和喂养持续时间（1或8周） 阅读提示：Methods部分Mice小节 |
| 瘦素敏感性测试 | 小鼠年龄（12周龄）、HFD喂养状态、瘦素剂量（2 mg/kg体重）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每日一次，连续3天）和对照（PBS） 阅读提示：Methods部分Leptin treatment in mice小节及Fig. 3图注 |
| Parabiosis实验 | 小鼠性别（雌性）、年龄（7周龄）、配对分组（WT:WT、Sel1LPOMC:Sel1LPOMC、WT:Sel1LPOMC）、恢复时间（2周）和HFD持续时间（8周） 阅读提示：Methods部分Parabiosis小节及Fig. 4图注 |
| pSTAT3免疫荧光检测 | 禁食时间（过夜）、瘦素剂量（2 mg/kg体重）、注射后检测时间（30分钟）和灌注固定方法 阅读提示：Methods部分Leptin treatment in mice小节及Fig. 5图注 |
| HEK293T细胞瘦素信号实验 | 细胞系（HEK293T，WT或HRD1−/−）、转染质粒（mLepRb-3xFlag）、瘦素浓度（100 nM）、处理时间（30分钟）和血清饥饿条件 阅读提示：Methods部分及Fig. 7图注 |