建立SMARCB1等基因细胞模型
构建SMARCB1缺陷与回补的等基因细胞系以进行合成致死筛选
将SMARCB1 cDNA导入SMARCB1缺陷的JMU-RTK-2横纹肌样瘤细胞，建立JMU-RTK-2+SMARCB1细胞，并通过免疫印迹验证SMARCB1蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向CBP/p300旁系同源对以对抗SMARCB1缺陷癌症中KREMEN2的去抑制
Targeting dependency on a paralog pair of CBP/p300 against de-repression of KREMEN2 in SMARCB1-deficient cancers.
实验完整度
高包含细胞系、异种移植动物模型及多种组学、分子机制验证
主要模型
SMARCB1缺陷及回补的JMU-RTK-2等基因细胞系 SMARCB1正常与缺陷的多种癌细胞系 SMARCB1缺陷及正常的肿瘤异种移植小鼠模型
重点核对
SMARCB1缺陷与正常细胞系的生长抑制及IC50差异 KREMEN2敲低降低SMARCB1缺陷细胞活力，过表达KREMEN2可挽救 CUT&RUN-qPCR检测SMARCB1、CBP/p300及组蛋白修饰在KREMEN2基因座的定位 NanoBiT检测KREMEN2对KREMEN1同源二聚化的影响 CP-C27在异种移植模型中的肿瘤生长抑制及H3K27ac、cleaved PARP、AKT pS473变化
摘要
SMARCB1是SWI/SNF染色质重塑复合物的一个亚基，是横纹肌样瘤和上皮样肉瘤的致病基因。在这里，我们通过基于“同时抑制一个旁系同源对”概念的双重siRNA筛选方法，鉴定出CBP和p300的旁系同源对作为SMARCB1缺陷癌症中的合成致死靶点。用CBP/p300双重抑制剂处理可抑制源自SMARCB1缺陷细胞的细胞系和肿瘤异种移植物的生长，但不能抑制源自SMARCB1正常细胞的生长。含有SMARCB1的SWI/SNF复合物与H3K27me3及其甲基转移酶EZH2一起定位在KREMEN2基因座的启动子区域，导致KREMEN2的转录下调。相比之下，SMARCB1缺陷导致H3K27ac及其乙酰转移酶CBP和p300募集到KREMEN2基因座，导致KREMEN2的转录上调，后者与SMARCA1染色质重塑复合物协同作用。同时抑制CBP/p300导致KREMEN2的转录下调，随后由于KREMEN1未能与KREMEN2相互作用而导致KREMEN1单体化，从而诱导凋亡，这抑制了抗凋亡信号通路。综上所述，我们的发现表明CBP/p300的同时抑制剂可能是治疗SMARCB1缺陷癌症的有前景的治疗剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否将旁系同源对作为SMARCB1缺陷癌症的合成致死靶点，并阐明其作用机制？
- 核心机制
- SMARCB1缺陷导致CBP/p300介导的KREMEN2转录上调；同时抑制CBP/p300下调KREMEN2，引起KREMEN1单体化，进而抑制抗凋亡信号通路并诱导凋亡。
- 主要证据
- 通过SMARCB1等基因细胞系和多种癌细胞系的siRNA及抑制剂实验、CUT&RUN/ChIP-seq、RNA-seq、NanoBiT及异种移植模型，验证CBP/p300双重抑制的选择性杀伤作用及KREMEN2-KREMEN1轴。
- 研究意义
- 提示CBP/p300双重抑制剂可能是SMARCB1缺陷癌症的有前景治疗剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双siRNA筛选旁系同源对
鉴定SMARCB1缺陷细胞的合成致死旁系同源对
针对30个染色质调节因子旁系同源对进行双siRNA转染，在HEK293T、JMU-RTK-2+SMARCB1和JMU-RTK-2-SMARCB1细胞中检测细胞活力。
验证CBP/p300双重抑制的合成致死效应
确认CREBBP+EP300同时抑制对SMARCB1缺陷细胞的特异性杀伤
在多种SMARCB1正常和缺陷癌细胞系中单独或同时敲低CREBBP和EP300，并用CBP/p300抑制剂A-485、inobrodib、CP-C27处理，检测细胞活力和IC50。
鉴定KREMEN2为合成致死决定因子
筛选CBP/p300抑制后SMARCB1缺陷细胞中下调且与合成致死相关的基因
利用RNA-seq比较SMARCB1缺陷与正常细胞及A-485处理后的基因表达，交集分析鉴定KREMEN2；通过敲低和过表达KREMEN2验证其对细胞活力的影响。
解析KREMEN2基因座的染色质状态和转录调控
阐明SMARCB1缺陷导致KREMEN2去抑制的表观遗传机制
用CUT&RUN-seq、ChIP-seq、CUT&RUN-qPCR和ATAC-seq检测H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3、CBP、p300、EZH2、SMARCB1及SWI/SNF亚基在KREMEN2基因座的定位，以及染色质开放性和转录。
验证CBP/p300抑制通过KREMEN2-KREMEN1轴诱导凋亡
确定KREMEN2下调后通过KREMEN1单体化诱导凋亡的机制
用Annexin V/PI染色检测凋亡，RNA-seq和qPCR检测CASP6/CASP9，NanoBiT检测KREMEN1同源二聚化，敲低KREMEN1挽救实验，以及磷酸化蛋白阵列和免疫印迹检测AKT/PRAS40磷酸化。
评估CBP/p300抑制剂体内抗肿瘤效果
验证CP-C27在SMARCB1缺陷肿瘤异种移植模型中的生长抑制作用
将SMARCB1缺陷G401或JMU-RTK-2细胞及SMARCB1正常H460细胞皮下接种裸鼠，给予CP-C27或对照，监测肿瘤体积和重量，并进行免疫组化和免疫印迹分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Wako | 048-29785 |
| 胎牛血清 | Gibco/Life Technologies | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 41550021 | |
| 青霉素-链霉素 | Wako | 168-23191 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7571 |
| 药物处理 | A-485 | TOCRIS | -- |
| inobrodib | MedChemExpress | -- | |
| 他泽司他 | Selleck | -- | |
| valemetostat | Selleck | -- | |
| CP-C27 | -- | -- | |
| mRNA定量 | SuperPrep II细胞裂解及RT试剂盒 | TOYOBO | SCQ-401 |
| THUNDERBIRD探针qPCR预混液 | TOYOBO | QPS101 | |
| TaqMan基因表达检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Wako | 188-02453 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Active Motif | 37490 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Active Motif | 37492 | |
| Pierce 660 nm蛋白检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | 22660 | |
| Can Get Signal PVDF封闭试剂 | TOYOBO | NYPBR01 | |
| Can Get Signal溶液1 | TOYOBO | NKB-201 | |
| Western Lightning ECL Pro发光试剂 | Perkin Elmer | NEL120001EA | |
| ECL Prime免疫印迹系统 | Cytiva | RPN2232 | |
| 抗SMARCB1抗体 | CST | 91735 | |
| 抗CBP抗体 | CST | 7425 | |
| 抗p300抗体 | CST | 54062 | |
| 抗H3K27ac抗体 | CST | 8173 | |
| 抗KREMEN2抗体 | LSBio | LS-C165609 | |
| 抗KREMEN1抗体 | LSBio | LS-C97716 | |
| 抗AKT1抗体 | CST | 4691 | |
| 抗AKT pS473抗体 | CST | 4060 | |
| 抗PRAS40抗体 | CST | 2691 | |
| 抗PRAS40 pT246抗体 | CST | 2997 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 4970 | |
| HAT酶活检测 | SensoLyte HAT (p300)检测试剂盒 | ANASPEC | AS-72172 |
| 凋亡检测 | Annexin V–FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Roche | 11858777001 |
| NanoBiT检测 | Nano-Glo活细胞检测系统 | Promega | N2012 |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 磷酸化蛋白阵列 | Proteome Profiler人磷酸化激酶阵列试剂盒 | R&D Systems | ARY003C |
| CUT&RUN-seq | CUT&RUN检测试剂盒 | CST | 86652 |
| 抗H3K27ac抗体 | CST | 8173 | |
| 抗H3K27me3抗体 | CST | 9733 | |
| 抗H3K4me1抗体 | CST | 5326 | |
| 抗H3K4me3抗体 | CST | 9751 | |
| 抗SMARCB1抗体 | CST | 91735 | |
| 抗RNAPII (Rpb1)抗体 | CST | 2629 | |
| 抗CTCF抗体 | CST | 3418 | |
| 抗BRD4抗体 | CST | 13440 | |
| CUT&RUN-qPCR | 抗CBP抗体 | Abcam | ab253202 |
| 抗EZH2抗体 | CST | 5246 | |
| 抗SMARCA4抗体 | Abcam | ab110641 | |
| 抗ARID1A抗体 | Abcam | ab182560 | |
| 抗PBRM1抗体 | CST | 89123 | |
| 抗SS18抗体 | CST | 21792 | |
| 抗GLTSCR1抗体 | CST | 45441 | |
| 抗SMARCA1抗体 | CST | 12483 | |
| 正常IgG | CST | 66362 | |
| THUNDERBIRD Next SYBR qPCR预混液 | TOYOBO | QPX-201 | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | FC121-1030 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 甲基纤维素400溶液 | FUJIFILM Wako | 133-17815 | |
| 免疫组化 | 抗cleaved caspase-3 (Asp175)抗体 | CST | 9664 |
| 抗cleaved PARP (Asp214)抗体 | CST | 5625 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | EP16602 | |
| 抗AKT pS473抗体 | CST | 4060 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 双siRNA筛选 | siRNA浓度50 nM、转染48小时重复两次、孵育7天、细胞系来源 阅读提示：Methods细胞活力检测部分及Figure 1b图注 |
| 抑制剂处理及IC50测定 | 抑制剂处理浓度、处理6天、细胞接种密度250-1000细胞/孔 阅读提示：Methods细胞活力检测部分及Figure 1j-m图注 |
| RNA-seq分析 | A-485 2 μM或CP-C27 0.2 μM处理24小时、siRNA转染48小时重复两次 阅读提示：Methods RNA-seq分析部分 |
| CUT&RUN-qPCR | 抗体用量2 μL、细胞数1×10^5、CP-C27 0.2 μM处理24小时 阅读提示：Methods CUT&RUN-qPCR部分及Figure 3l,m图注 |
| 异种移植模型 | 细胞接种量5×10^5细胞/小鼠、CP-C27剂量3-30 mg/kg、给药频率每日一次或两次、治疗14-28天 阅读提示：Methods小鼠异种移植模型部分及Figure 7图注 |