构建肌肉特异性TAZ敲除小鼠并评估线粒体表型
验证TAZ缺失对骨骼肌线粒体质量、呼吸代谢和运动能力的影响。
使用MCK-cre;Tazf/f（mKO）小鼠，通过透射电镜计数线粒体数量和面积，免疫印迹检测线粒体标志蛋白，代谢笼分析呼吸代谢和活动，转棒和跑台测试运动能力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TAZ通过线粒体转录因子A将运动与线粒体生物发生联系起来
TAZ links exercise to mitochondrial biogenesis via mitochondrial transcription factor A.
实验完整度
高包含肌肉特异性敲除小鼠、MEF和C2C12细胞模型，以及体内回补、ChIP、多聚核糖体谱等功能和机制验证。
主要模型
肌肉特异性TAZ敲除（mKO）小鼠 WT与TAZ KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） C2C12成肌细胞/肌管 HEK293T细胞
重点核对
mKO小鼠的线粒体数量、面积及呼吸代谢和运动能力检测 TAZ KO MEF和TAZ KD C2C12中Tfam蛋白与mRNA水平及翻译相关信号检测 ChIP-qPCR验证TAZ和TEAD4结合Rhebl1增强子TBE区域 AAV6介导Rhebl1回补mKO小鼠肌肉后线粒体蛋白和mtDNA拷贝数检测 mTOR激活剂MHY1485处理mKO小鼠后线粒体生物发生指标检测
摘要
线粒体是产生能量的细胞器，线粒体生物发生受到刺激以满足响应细胞外刺激（包括运动）的能量需求。然而，线粒体生物发生的机制尚不清楚。在此，我们证明含有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）刺激骨骼肌中的线粒体生物发生。在肌肉特异性TAZ敲除（mKO）小鼠中，与野生型小鼠相比，线粒体生物发生、呼吸代谢和运动能力均降低。机制上，TAZ通过Ras homolog enriched in brain（Rheb）/Rheb like 1（Rhebl1）-mTOR轴刺激线粒体转录因子A的翻译。TAZ通过TEA结构域家族转录因子刺激Rhebl1表达。通过腺相关病毒引入Rhebl1或激活mTOR可恢复mKO肌肉中的线粒体生物发生。在生理学上，mKO小鼠不能刺激运动诱导的线粒体生物发生。总之，我们的结果表明TAZ是线粒体生物发生和运动诱导的肌肉适应的新型刺激因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TAZ是否以及如何调控骨骼肌线粒体生物发生，并介导运动诱导的肌肉适应。
- 核心机制
- TAZ通过TEAD转录因子促进Rhebl1表达，激活Rheb/Rhebl1-mTOR轴，抑制4E-BP1并促进Tfam翻译，从而刺激线粒体生物发生。
- 主要证据
- mKO小鼠线粒体数量、呼吸代谢和运动能力下降；TAZ缺失细胞中Tfam蛋白降低而mRNA不变，多聚核糖体谱显示Tfam mRNA翻译效率下降；Rhebl1或mTOR激活剂回补可恢复mKO肌肉线粒体生物发生；运动训练不能诱导mKO小鼠线粒体生物发生。
- 研究意义
- 提出TAZ是线粒体生物发生的新型刺激因子，与PGC1α分别通过翻译和转录调控Tfam，共同促进运动诱导的肌肉适应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证TAZ对线粒体生物发生的影响
在细胞模型中验证TAZ缺失对线粒体活性、mtDNA拷贝数和ATP产生的影响。
使用WT和TAZ KO MEF以及TAZ KD C2C12肌管，通过MitoTracker染色、mtDNA拷贝数定量、ATP生物发光和OCR测定分析线粒体功能。
确定TAZ在翻译水平调控Tfam
探究TAZ是否通过翻译调控Tfam表达。
检测mKO肌肉、TAZ KO MEF和TAZ KD C2C12中Tfam mRNA和蛋白水平，以及4E-BP1和S6K磷酸化；通过多聚核糖体谱分析Tfam mRNA翻译分布。
验证TAZ通过TEAD调控Rhebl1表达
确定TAZ调控Rhebl1表达的分子机制。
检测mKO肌肉、TAZ KO MEF和TAZ KD C2C12中Rhebl1和Rheb表达；ChIP-qPCR验证TAZ和TEAD4结合Rhebl1增强子TBE；荧光素酶报告基因验证转录活性。
回补Rhebl1或激活mTOR恢复mKO小鼠线粒体生物发生
验证Rhebl1和mTOR在TAZ介导的线粒体生物发生中的作用。
通过AAV6在mKO小鼠肌肉中表达Rhebl1，或腹腔注射mTOR激活剂MHY1485，检测线粒体蛋白、mtDNA拷贝数和线粒体编码基因表达。
评估TAZ在运动诱导线粒体生物发生中的作用
验证TAZ是否介导运动诱导的线粒体生物发生。
对WT和mKO小鼠进行4周耐力运动训练，检测线粒体标志蛋白、mtDNA拷贝数、线粒体编码基因和核编码基因表达，以及呼吸代谢和线粒体呼吸功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| Western blot | 抗细胞色素C抗体 | Cell Signaling Technology | 4280 |
| 抗Cox4抗体 | Cell Signaling Technology | 4850 | |
| 抗Sdha抗体 | Cell Signaling Technology | 5839 | |
| 抗Vdac抗体 | Cell Signaling Technology | 4661 | |
| 抗Hsp60抗体 | Cell Signaling Technology | 4870 | |
| 抗Rheb抗体 | Cell Signaling Technology | 13879 | |
| 抗磷酸化4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9451 | |
| 抗4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9452 | |
| 抗磷酸化p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2603 | |
| 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| 抗TAZ/YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 4912 | |
| 抗Rhebl1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514095 | |
| 抗α-Tubulin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5286 | |
| 抗PGC1α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13067 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166574 | |
| 抗Tead4抗体 | Abcam | ab58310 | |
| 免疫荧光 | 抗细胞色素c氧化酶亚基2抗体 | Abcam | ab198286 |
| Western blot | 抗Nrf1抗体 | Abcam | ab34682 |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab88746 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗β-Actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 抗Tfam抗体 | Aviva Systems Biology | ARP36992-P050 | |
| 抗TAZ抗体 | Novus Biologicals | NB110-58359 | |
| 免疫荧光 | 荧光团标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11008 |
| Western blot | HRP标记二抗 | Enzo Life Sciences | ADI-SAB-300-J |
| HRP标记二抗 | Enzo Life Sciences | ADI-SAB-100-J | |
| 质粒构建 | pGL3基本载体 | Promega | -- |
| Phusion聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530L | |
| pCMV6-Rhebl1质粒 | Origene | MR215936 | |
| NEBuilder高保真DNA组装预混液 | New England Biolabs | E2621L | |
| pAAV6-CMV载体 | Takara Bio | 6651 | |
| EcoRI限制酶 | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| pSRP-mTAZ质粒 | Addgene | 31795 | |
| pBabe puro-mTAZ质粒 | Addgene | 31791 | |
| 病毒包装 | AAVpro 293T细胞 | Takara Bio | 632273 |
| TransIT-VirusGEN转染试剂 | Mirus Bio | MIR 6700 | |
| AAV提取液 | Takara Bio | 6666 | |
| AAVpro滴定试剂盒 | Takara Bio | 6233 | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| mTOR激活剂处理 | MHY1485 | ChemScene | CS-3946 |
| siRNA转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| Western blot | Bio-Rad凝胶电泳系统 | Bio-rad | -- |
| ChIP-qPCR | 蛋白G磁珠 | Sigma Aldrich | P-3296 |
| 凝胶提取/PCR纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| M-MLV逆转录酶 | -- | -- | |
| 多聚核糖体谱分析 | SW-41 Ti转子 | Beckman Coulter | -- |
| ISCO管穿刺器 | Brandel | -- | |
| 馏分收集器 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光素酶报告基因测定 | Xtremegene 9转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 双荧光素酶报告基因测定 | Promega | -- | |
| MitoTracker染色 | MitoTracker Red CMXROS | Invitrogen | -- |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM 510META | |
| ATP生物发光测定 | ATP生物发光HS II试剂盒 | Roche | -- |
| 发光检测仪 | Promega | GLOMAX | |
| 耗氧率测定 | XF24通量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 线粒体分离 | 组织线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89801 |
| ROS检测 | CM-H2DCFDA | Invitrogen | -- |
| 电子显微镜 | EMBed 812包埋剂 | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| 免疫荧光 | 含DAPI封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| 代谢参数测定 | Oxylet系统 | Panlab | -- |
| 转棒测试 | 转棒疲劳仪 | Med Associates | ENV-574M |
| qPCR | Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与分组 | mKO小鼠构建策略（MCK-cre;Tazf/f）、周龄（8-12周）及WT对照 阅读提示：Methods中Mice小节及图注 |
| 运动训练方案 | 跑台速度、坡度、时长、每周训练天数及取材时间 阅读提示：Methods中Exercise training小节 |
| AAV6介导的基因递送 | 病毒注射量（5×10^10 vector genomes）、注射体积（50 μl）、注射位点及取材时间 阅读提示：Methods中Adeno-associated virus production and local transduction into mouse muscle小节 |
| mTOR激活剂处理 | MHY1485剂量（原文为10 mg/g体重）、给药途径（腹腔注射）、频率（每2天一次）和持续时间（2周） 阅读提示：Methods中mTOR activator administration into mice小节 |
| 多聚核糖体谱分析 | 蔗糖梯度浓度（10-50%）、离心条件及mRNA分布检测方法 阅读提示：Methods中Polysome profiling小节 |