AML患者样本中RNF5表达与预后分析
评估RNF5在AML中的临床相关性及预后价值
分析CCLE数据库、AML患者PBMC样本中RNF5蛋白和mRNA水平，并进行Kaplan-Meier生存分析
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泛素连接酶RNF5决定急性髓系白血病的生长及对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的敏感性
The ubiquitin ligase RNF5 determines acute myeloid leukemia growth and susceptibility to histone deacetylase inhibitors.
实验完整度
高含AML细胞系、PDX、患者样本、异种移植和MLL-AF9小鼠模型，并做功能与机制验证（KD、CRISPR、ChIP、LC-MS/MS）
主要模型
AML细胞系MOLM-13、U937、HL-60、THP-1 患者来源AML细胞（PDX AML-669） U937-pGFL异种移植NOD/SCID小鼠模型 MLL-AF9转导的Rnf5−/−与WT小鼠骨髓HSPC及白血病小鼠模型
重点核对
RNF5敲低或敲除（shRNF5、sgRNA）在AML细胞系中的生长抑制和凋亡诱导 RNF5与RBBP4相互作用及K29泛素链形成的免疫共沉淀和突变体实验 RNF5缺失降低RBBP4在ANXA1、NCF1、CDKN1A启动子的富集及组蛋白乙酰化变化（ChIP-qPCR） RNF5或RBBP4缺失增强AML细胞对HDAC抑制剂（CI-994、FK228）的敏感性 U937异种移植和MLL-AF9小鼠模型中RNF5缺失延缓白血病进展并延长生存
摘要
急性髓系白血病（AML）仍难以治愈，主要归因于其对常规治疗的耐药。本研究发现，泛素连接酶RNF5丰度增加促进AML的发生和存活。AML患者标本中RNF5高表达与不良预后相关。抑制RNF5可降低AML细胞在培养中、患者来源异种移植（PDX）样本中以及体内的生长，并延缓MLL-AF9驱动的白血病发生，延长小鼠生存。抑制RNF5引起的转录变化与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1抑制所见的变化重叠。RNF5诱导组蛋白结合蛋白RBBP4上K29泛素链的形成，促进其招募至参与AML维持的基因并随后对这些基因进行表观遗传调控。相应地，敲低RNF5或RBBP4增强AML细胞对HDAC抑制剂的敏感性。值得注意的是，RNF5和HDAC均低表达与良好预后一致。我们的研究确定了RNF5不依赖ERAD的作用，证明其对RBBP4的调控构成驱动AML的表观遗传通路，并强调RNF5/RBBP4可作为标志物用于对患者进行HDAC抑制剂治疗的分层。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF5在AML发生发展中的作用及其分子机制是什么，是否影响AML对HDAC抑制剂的敏感性？
- 核心机制
- RNF5作为泛素连接酶，不依赖ERAD，通过诱导RBBP4的K29连接多聚泛素化，促进RBBP4招募至特定基因启动子，进而表观遗传调控AML维持相关基因。
- 主要证据
- AML细胞系中RNF5敲低/敲除抑制生长并诱导凋亡；PDX和异种移植及MLL-AF9小鼠模型中RNF5缺失延缓白血病进展；LC-MS/MS和Co-IP证实RNF5与RBBP4相互作用；K29泛素突变体实验证明RNF5介导RBBP4的K29泛素化；ChIP-qPCR显示RNF5缺失降低RBBP4启动子富集并改变组蛋白修饰。
- 研究意义
- 研究确定了RNF5-RBBP4轴在AML维持和对HDAC抑制剂反应中的核心作用，提示RNF5/RBBP4丰度可作为预后标志物并用于对AML患者进行HDAC抑制剂治疗的分层。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNF5敲低/敲除对AML细胞体外生长的影响
验证RNF5对AML细胞增殖和存活的功能必要性
在MOLM-13、U937、HL-60、THP-1等AML细胞系中使用shRNA或CRISPR-Cas9敲低/敲除RNF5，检测细胞活力、细胞周期、集落形成和凋亡标志物
RNF5缺失在PDX和异种移植模型中的体内验证
评估RNF5抑制对AML体内生长和生存的影响
将转导shRNF5的PDX AML-669细胞或U937-pGFL细胞移植到小鼠，监测白血病负荷和生存
MLL-AF9驱动白血病模型中Rnf5缺失的影响
验证RNF5在AML起始和进展中的作用
将GFP-MLL-AF9转导至Rnf5−/−和WT小鼠骨髓HSPC，进行集落形成实验和移植小鼠
RNF5调控转录及与HDAC抑制剂转录特征重叠分析
探究RNF5调控的转录程序及与HDAC抑制的关联
对RNF5敲低的MOLM-13、U937、HL-60进行RNA-seq，并与LINCS数据库HDAC抑制剂特征比较
RNF5与RBBP4相互作用及泛素化机制解析
鉴定RNF5的底物及泛素链类型
LC-MS/MS鉴定RNF5相互作用蛋白，Co-IP验证相互作用，使用K-only泛素突变体鉴定K29泛素链
RNF5通过RBBP4调控基因启动子招募和组蛋白修饰
验证RNF5-RBBP4轴对靶基因的表观遗传调控
ChIP-qPCR检测RBBP4在ANXA1、NCF1、CDKN1A启动子的富集及H3K9ac、H3K27ac、H3K27me3修饰
RNF5/RBBP4缺失增强AML对HDAC抑制剂的敏感性
评估RNF5/RBBP4作为HDAC抑制剂敏感性标志物的潜力
使用261种表观遗传抑制剂筛选，验证CI-994和FK228在RNF5或RBBP4敲低AML细胞中的敏感性，并在原代AML blast中验证
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | D-荧光素 | PerkinElmer | 122799 |
| 多西环素饲料 | Bio-Serv | -- | |
| 细胞培养 | Ficoll-Paque PLUS分离液 | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| 人红细胞裂解液 | Alfa Aesar | J62990 | |
| Bambanker无血清冻存液 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G7572 |
| Western blot | 抗切割型caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9532 | |
| 抗RBBP4抗体 | Novus Biologicals | NBP1-41201 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T9026 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 抗HA抗体 | Biolegend | 901501 | |
| 抗HDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 2062 | |
| 抗HDAC2抗体 | Cell Signaling Technology | 57156 | |
| 抗Ezh2抗体 | Cell Signaling Technology | 5246 | |
| 抗HSP90抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13119 | |
| 抗p27抗体 | Cell Signaling Technology | 3688 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3939 | |
| 抗K63连接特异性多聚泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9717 | |
| 抗caspase-3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56053 | |
| 抗钙网蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166837 | |
| 山羊抗小鼠HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | AB_2338504 | |
| 山羊抗兔HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | AB_2337938 | |
| 药物处理 | 罗米地辛 | Cayman Chemicals | -- |
| N-乙酰地那林 | Cayman Chemicals | -- | |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MG132 | Selleckchem | -- | |
| 嘌呤霉素 | Merck | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-APC | BioLegend | -- |
| 碘化丙啶 | BioLegend | -- | |
| 质粒构建 | NEBuilder HiFi组装试剂盒 | New England BioLabs | -- |
| 转染 | CalFectin转染试剂 | SignaGen | -- |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| LC-MS/MS | 抗Flag-M2琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 集落形成实验 | 软琼脂（低熔点琼脂糖） | Bio-Rad | -- |
| 结晶紫 | Merck | -- | |
| 甲基纤维素M3234 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 白介素-3 | PeproTech | -- | |
| 白介素-6 | PeproTech | -- | |
| 干细胞因子 | PeproTech | -- | |
| RT-qPCR | GenElute哺乳动物总RNA纯化试剂盒 | Sigma | -- |
| qScript cDNA合成试剂盒 | Quanta | -- | |
| SYBR Green I染料预混液 | Roche | -- | |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗H3K9ac抗体 | Cell Signaling Technology | 9649 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab3594 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Millipore | -- | |
| 表观遗传抑制剂筛选 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNF5敲低细胞实验 | shRNF5序列、转导后检测时间（5天）、DOX诱导浓度（1 µg/ml） 阅读提示：Methods基因沉默和转染转导小节；Fig. 2图注 |
| U937异种移植模型 | 细胞接种数量（2×10^4/只）、注射途径（静脉）、小鼠品系（NOD/SCID）、照射剂量（2.5 Gy）、DOX饲料浓度（200 mg/kg） 阅读提示：Methods动物研究小节；Fig. 4图注 |
| MLL-AF9白血病模型 | HSPC来源（Rnf5−/−或WT C57BL/6骨髓）、移植细胞数（1×10^6/只）、照射剂量（650 Rad）、受体小鼠年龄（6–8周） 阅读提示：Methods MLL-AF9转化和白血病小鼠生成小节；Fig. 4图注 |
| HDAC抑制剂敏感性实验 | FK228处理浓度（最高6 nM）和时间（24小时）、CI-994处理时间（24小时）、细胞活力检测方法 阅读提示：Methods原代AML细胞药物剂量反应和细胞活力检测小节；Fig. 7图注 |
| ChIP-qPCR | 交联条件（1%甲醛，10分钟）、超声剪切片段大小（200–1000 bp）、抗体用量、qPCR引物序列 阅读提示：Methods染色质免疫沉淀小节；Supplementary Table 4 |