RIPK1泛素化位点突变体的筛选
确定RIPK1-DD中关键泛素化位点对细胞死亡的影响。
用WT RIPK1或K20R、K105R、K392/K395R、K612R等突变体重建Ripk1−/− MEFs，检测TNFα/SM-164或TNFα/5Z-7诱导的RDA和坏死性凋亡。
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RIPK1的泛素化以不同方式调控其由TNFR1和TLRs信号介导的激活
Ubiquitination of RIPK1 regulates its activation mediated by TNFR1 and TLRs signaling in distinct manners.
实验完整度
高包含体外细胞模型、基因敲入小鼠模型，并进行功能验证和机制验证（泛素化、相互作用、信号通路）。
主要模型
Ripk1K612R/K612R敲入小鼠 Ripk1−/− MEFs reconstituted with RIPK1 WT或K612R 原代BMDMs HEK293T细胞
重点核对
Ripk1K612R/K612R敲入小鼠的构建与基因型鉴定 TNFα/SM-164/zVAD.fmk等处理下细胞存活率检测 LPS或Poly(I:C)刺激下BMDMs的坏死性凋亡和caspase-1激活检测 抗生素治疗对肠道炎症和脾肿大的挽救实验 RIPK1泛素化位点的质谱鉴定与定量分析
摘要
RIPK1是一种含有死亡结构域（DD）的激酶，参与调控细胞凋亡、坏死性凋亡和炎症。已知RIPK1的激活受其DD介导的相互作用和泛素化调控，但潜在机制尚不完全清楚。本研究表明，人RIPK1-DD中的K627及其小鼠RIPK1-DD中的等效位点K612是一个关键的泛素化位点，调控RIPK1的整体泛素化模式及其与其他含DD蛋白的DD介导的相互作用。K627R/K612R突变抑制RIPK1的激活，并阻断TNFR1信号介导的细胞凋亡和坏死性凋亡。然而，Ripk1K612R/K612R突变使细胞对TLRs信号诱导的坏死性凋亡和caspase-1激活敏感。Ripk1K612R/K612R小鼠可存活，但出现年龄依赖性的RIPK1表达降低、自发性肠道炎症和脾肿大，这些可被抗生素治疗挽救，并部分被Ripk3缺陷挽救。此外，我们表明RIPK1与FADD的相互作用有助于抑制TLRs信号介导的RIPK3激活。我们的研究证明，mRIPK1中K612泛素化/hRIPK1中K627泛素化在调控其响应TNFα的促死亡激酶活性和响应TLRs信号的促存活活性中具有不同作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RIPK1-DD中的泛素化位点如何调控RIPK1的激活及其在TNFR1和TLRs信号中的不同功能？
- 核心机制
- K612/K627泛素化调控RIPK1的整体泛素化模式和DD介导的相互作用；在TNFR1信号中促进RIPK1激活和细胞死亡，在TLRs信号中通过促进RIPK1-FADD相互作用抑制RIPK3激活和caspase-1活化。
- 主要证据
- 通过Ripk1K612R/K612R敲入小鼠、MEFs和BMDMs模型，结合细胞存活实验、免疫共沉淀、Western blot和定量质谱，证明K612R突变抑制TNFα诱导的RIPK1激活和细胞死亡，但增强TLRs诱导的坏死性凋亡和caspase-1激活；抗生素和Ripk3缺陷可挽救小鼠肠道炎症。
- 研究意义
- 揭示了RIPK1-DD和K612/K627泛素化在维持肠道稳态中的重要作用，为理解RIPK1介导的炎症反应和细胞死亡交叉调控提供了机制见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Ripk1K612R/K612R敲入小鼠的构建与表征
研究K612R突变在体内的功能后果。
利用CRISPR/Cas9技术构建Ripk1K612R/K612R小鼠，观察存活、生长、肠道炎症和脾肿大等表型。
K612R突变对TNFα诱导的RIPK1激活和复合物形成的影响
阐明K612R突变抑制RDA和坏死性凋亡的机制。
在Ripk1+/+和Ripk1K612R/K612R MEFs中，用TNFα/SM-164或TNFα/5Z-7刺激，检测RIPK1磷酸化、caspase-8切割、复合物IIa和IIb形成以及复合物I的 recruitment。
K612R/K627R突变对RIPK1泛素化模式的影响
分析K612/K627泛素化位点对RIPK1整体泛素化模式的调控。
在HEK293T细胞中转染hRIPK1-WT或K627R，以及在小鼠MEFs中，利用Western blot和定量质谱分析K48、K63、M1泛素化及泛素化位点变化。
K612R突变对TLRs信号诱导的坏死性凋亡和caspase-1激活的影响
探究K612R突变在TLRs信号中的作用。
用LPS或Poly(I:C)刺激WT和Ripk1K612R/K612R BMDMs，检测细胞死亡、RIPK1/RIPK3/MLKL磷酸化、复合物IIb形成、caspase-1切割和IL-1β分泌。
抗生素治疗和Ripk3缺陷对小鼠肠道炎症的挽救
验证肠道菌群和RIPK3在K612R小鼠炎症中的作用。
给断奶后小鼠饮用含抗生素的水4周，或构建Ripk1K612R/K612R; Ripk3−/−小鼠，评估体重、脾重、结肠长度、炎症细胞因子和免疫细胞浸润。
K612R/K627R突变对RIPK1同源和异源二聚化的影响
确定K612/K627在DD介导的相互作用中的作用。
在HEK293T细胞中共转染RIPK1变体和DD结构域，免疫共沉淀检测相互作用；利用诱导型二聚化系统（2xFV-RIPK1或2xFV-RIPK3）评估二聚化对细胞死亡的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibico | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibico | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| L929条件培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 人重组可溶性TNFα | Novoprotein Scientific | -- |
| 小鼠重组可溶性TNFα | R&D Systems | -- | |
| 5Z-7-氧杂玉米赤霉烯酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| GSK’872 | Calbiochem | -- | |
| Z-VAD.fmk | Selleckchem | -- | |
| R-7-Cl-O-Nec-1 | -- | -- | |
| SM-164 | -- | -- | |
| Western blot | RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493 |
| A20抗体 | Cell Signaling Technology | 5630 | |
| Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| cleaved Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9216 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4671 | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2078 | |
| IKKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2682 | |
| IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 2370 | |
| 小鼠磷酸化RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 91702 | |
| 小鼠磷酸化S345-MLKL抗体 | Abcam | ab196436 | |
| FADD抗体 | Abcam | ab124812 | |
| 小鼠FADD抗体 | Santa Cruz | SC-6036 | |
| TRAF2抗体 | Santa Cruz | SC-876 | |
| TNFRSF1A抗体 | Santa Cruz | SC-8436 | |
| TRADD抗体 | Santa Cruz | SC-7868 | |
| RBCK1抗体 | Santa Cruz | SC-365523 | |
| GFP抗体 | Santa Cruz | SC8334 | |
| IKKγ抗体 | Santa Cruz | SC-8330 | |
| CYLD抗体 | Santa Cruz | SC-74435 | |
| SHARPIN抗体 | Proteintech | 14626-1-AP | |
| 肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009 | |
| Caspase-1 p20抗体 | Adipogen Life Science | AG-20B-0042 | |
| IL-1β抗体 | Gentex | GTX74034 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | 31430 | |
| 山羊抗大鼠IgG H&L | Abcam | ab214882 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab214880 | |
| 抗磷酸化S166小鼠RIPK1抗体 | Biolynx | -- | |
| 抗小鼠RIPK1兔单克隆抗体 | Biolynx | -- | |
| 抗小鼠RIPK3抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠MLKL抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠cIAP1抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠HOIL抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠HOIP抗体 | -- | -- | |
| 小鼠TNFRSF1A | R&D Systems | -- | |
| 免疫共沉淀 | Flag M2琼脂糖亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| K63泛素链抗体 | -- | -- | |
| 线性泛素链抗体 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗泛素化残基基序抗体 | PTM biolabs | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiterGlo试剂 | Promega | -- |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| M-MLV逆转录酶 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Biotool | -- | |
| Nanodrop ND-1000分光光度计 | Thermo scientific | -- | |
| 基因敲除 | LentiCRISPR v2载体 | -- | -- |
| 细胞因子检测 | TNFα ELISA试剂盒 | R&D | DY410 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D | DY406 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | R&D | DY401 | |
| 组织样本制备 | 组织研磨仪 | QIAGEN | -- |
| 流式细胞术 | 纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32 | Biolegend | 101302 |
| CD45抗体 | BD Bioscience | 553081 | |
| CD11b抗体 | Biolegend | 101212 | |
| Gr-1抗体 | Biolegend | 108406 | |
| CD3抗体 | Biolegend | 100221 | |
| B220抗体 | Biolegend | 103212 | |
| CD4抗体 | Biolegend | 100540 | |
| CD8抗体 | Biolegend | 100706 | |
| Guava easyCyte HT流式细胞仪 | Millipore | -- | |
| 组织学 | SignalStain DAB底物试剂盒 | CST | 8059 |
| 抗Ki67抗体 | CST | 12202 | |
| 抗F4/80抗体 | Biolegend | 123102 | |
| 抗Gr-1抗体 | BD | 550291 | |
| 溶菌酶抗体 | Invitrogen | PA5-16668 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞死亡检测 | TNFα浓度（100 ng/ml）、SM-164浓度（100 nM）、5Z-7浓度（200 nM）、zVAD.fmk浓度（25 μM）、处理时间（不同时间点） 阅读提示：Methods中“Cell viability assay”和图1图注 |
| TLRs刺激实验 | LPS浓度（50 ng/ml或100 ng/ml）、Poly(I:C)浓度（20 μg/ml）、Z-VAD浓度（25 μM）、刺激时间（10小时或不同时间点） 阅读提示：图6图注和Methods中“Cell viability assay” |
| 抗生素治疗 | 抗生素混合物组成（200 mg环丙沙星、1 g氨苄青霉素、1 g甲硝唑、500 mg万古霉素每升水）、治疗时长（4周）、小鼠年龄（3-4周开始） 阅读提示：Methods中“Depletion of commensal bacteria”和图5图注 |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液组成（50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 10% glycerol等）、抗体孵育条件（过夜4°C）、清洗次数 阅读提示：Methods中“Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis” |
| 定量质谱分析 | 细胞数量（15个150 mm培养皿）、TNF刺激时间（5分钟）、蛋白酶切和diGly肽段富集方法 阅读提示：Methods中“Immunoprecipitation of endogenous RIPK1 for quantitative mass spec analysis”和“Mass spectrometry” |