TRAF3IP3通过促进TBK1 K48泛素化负向调控胞质RNA诱导的抗病毒信号

TRAF3IP3 negatively regulates cytosolic RNA induced anti-viral signaling by promoting TBK1 K48 ubiquitination.

作者信息Meng Deng, Jason W Tam, Lufei Wang, Kaixin Liang, Sirui Li, Lu Zhang, Haitao Guo, Xiaobo Luo, Yang Zhang, Alex Petrucelli, Beckley K Davis, Brian J Conti, W June Brickey, Ching-Chang Ko, Yu L Lei, Shaocong Sun, Jenny P-Y Ting

PMID32366851

期刊Nat Commun

发布时间2020-05-04

DOI10.1038/s41467-020-16014-0

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实验完整度

高

包含过表达细胞系、CRISPR敲除THP-1、原代BMDM与髓系特异性基因敲除小鼠多层级证据，并含相互作用、泛素化及体内感染验证

主要模型

HEK293T细胞过表达系统 THP-1细胞CRISPR/Cas9敲除 Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+小鼠原代BMDM 髓系特异性Traf3ip3敲除小鼠VSV感染模型

重点核对

HEK293T中Myc-TRAF3IP3梯度转染（0、100、200 ng）后poly(I:C)、poly(dA:dT)、5’ppp-dsRNA转染6 h或VSV感染（MOI=0.5）6 h THP-1中scramble或两条TRAF3IP3 sgRNA敲除后poly(I:C)转染或VSV感染（MOI=1） Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+与Cre− BMDM经poly(I:C)转染或VSV感染（MOI=1或2）后检测Ifnb1、IFN-β及TBK1/IRF3磷酸化小鼠腹腔注射VSV 0.5×10^7 pfu，监测体重、生存率及8 h血清IFN-β、24 h组织病毒载量内源性共免疫沉淀验证TRAF3IP3与TRAF3、TBK1相互作用及TBK1 K48泛素化

摘要

对核酸的天然免疫是抗病毒免疫和多种炎症疾病的基础。感知胞质病毒RNA后，维甲酸诱导基因I样受体（RLRs）与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用并激活TANK结合激酶1（TBK1），以诱导I型干扰素（IFN-I）。TRAF3相互作用蛋白3（TRAF3IP3，T3JAM）对T细胞和B细胞发育至关重要，其在髓系细胞中也有良好表达，但其在髓系细胞中的作用尚不清楚。本文报道，在过表达系统和Traf3ip3−/−原代髓系细胞中，TRAF3IP3抑制胞质poly(I:C)、5’ppp-dsRNA和 vesicular stomatitis virus（VSV）触发的IFN-I表达。其作用机制是TRAF3IP3与内源性TRAF3和TBK1相互作用，导致TBK1在其K372残基上以DTX4依赖的方式发生降解性K48泛素化。髓系特异性Traf3ip3基因缺失小鼠的RNA病毒触发IFN-I产生增加，对病毒的易感性降低。这些结果确定了TRAF3IP3在髓系细胞调控宿主对胞质病毒RNA应答中的功能。

过表达系统验证TRAF3IP3对IFN-I的抑制作用

确定TRAF3IP3是否影响胞质RNA诱导的IFN-I信号

在HEK293T细胞中转染IFN-β或ISRE荧光素酶报告基因及梯度Myc-TRAF3IP3，随后转染poly(I:C)、poly(dA:dT)、5’ppp-dsRNA或感染VSV，检测报告基因活性、IRF3磷酸化与核转位及IFN-β分泌

THP-1敲除验证内源性TRAF3IP3功能

验证内源性TRAF3IP3缺失是否增强胞质RNA诱导的IFN-I应答

用CRISPR/Cas9 sgRNA敲除THP-1细胞TRAF3IP3，经poly(I:C)转染或VSV感染后检测TBK1、IRF3、STAT1磷酸化及IFNB1、ISG15 mRNA和IFN-β蛋白

髓系特异性Traf3ip3敲除小鼠原代BMDM验证

在原代髓系细胞中验证TRAF3IP3对胞质RNA和VSV应答的负调控作用

从Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+与Cre−小鼠制备BMDM，经poly(I:C)转染或VSV感染后检测Ifnb1 mRNA、IFN-β蛋白、TBK1/IRF3/STAT1/p38/p65/ERK/4E-BP1磷酸化及VSV-G

机制解析：相互作用、竞争与TBK1泛素化降解

阐明TRAF3IP3抑制TBK1-IRF3轴的分子机制

通过共免疫沉淀和结构域映射检测TRAF3IP3与TBK1、TRAF3相互作用，验证其竞争MAVS结合，利用K48/K63泛素突变体、TBK1赖氨酸突变体及DTX4/TRIP/TRIM27敲低确定泛素化类型、位点和E3连接酶

体内验证髓系Traf3ip3缺失对VSV感染的影响

评估TRAF3IP3在体内抗病毒宿主防御中的生理相关性

Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+与Cre−小鼠腹腔注射VSV，监测体重和生存率，检测血清IFN-β、组织Ifnb1 mRNA、VSV-G及病毒滴度

实验环节	名称	品牌	货号
细胞刺激	聚肌胞苷酸	Invivogen	tlrl-pic
聚脱氧腺苷-脱氧胸苷	Invivogen	ttlrl-patn
5’三磷酸RNA	Invivogen	tlrl-3prna
脂质体2000	Thermo Scientific	11668027
脂质体LTX	Thermo Scientific	15338030
双荧光素酶报告基因实验	双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
质粒构建	pmCherry-N1载体	Takara	632523
siRNA敲低	对照siRNA	Origene	SR30004
TRAF3IP3 siRNA	Origene	SR312910A
TRAF3IP3 siRNA	Origene	SR312910C
慢病毒包装	pMD2.G包膜质粒	Addgene	12259
psPAX2包装质粒	Addgene	12260
慢病毒浓缩	慢病毒沉淀液	ALSTEM	VC100
CRISPR/Cas9敲除	lentiCRISPRv2载体	Addgene	52961
插入缺失频率检测	Guide-it突变检测试剂盒	Takara	631448
RNA提取与逆转录	TRIzol试剂	Thermo Scientific	15596026
iScript cDNA合成试剂盒	BIO-RAD	1708891
RT-qPCR	PowerUp SYBR Green预混液	Thermo Scientific	A25741
免疫荧光	抗IRF3抗体	CST	11904
AF546标记抗兔二抗	Thermo Scientific	A-11035
ELISA	LumiKine人IFN-β检测试剂盒	Invivogen	lumi-hifnb
抗IFN-β大鼠单克隆抗体	Santa Cruz	sc-57201
抗IFN-β兔多克隆抗体	R&D	32400-1
HRP标记山羊抗兔IgG	Cell Signaling	7074
免疫印迹	RIPA裂解液	Boston Bioproducts	BP-116TX
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	4906845001
硝酸纤维素膜	BIO-RAD	1620112
抗磷酸化TBK1（Ser172）抗体	CST	5483
抗TBK1/NAK抗体	CST	3504
抗磷酸化IRF-3（Ser396）抗体	CST	4947
抗IRF-3抗体	CST	11904
抗磷酸化Stat1（Ser727）抗体	CST	9177
抗Stat1抗体	CST	9172
抗磷酸化p65（Ser536）抗体	CST	3033
抗p65抗体	CST	8242
抗磷酸化p38（Thr180/Tyr182）抗体	CST	9216
抗磷酸化Erk1/2（Thr202/Tyr204）抗体	CST	4370
抗磷酸化4E-BP1（Thr37/46）抗体	CST	2855
抗Flag抗体	CST	14793
抗HA抗体	CST	3724
抗Myc抗体	CST	2276
抗V5抗体	CST	13202
抗VSV-G标签抗体	GeneScript	A00199
抗TRAF3IP3抗体	Santa Cruz	sc-366384
抗cGAS抗体	CST	15102
抗STING抗体	CST	13647
抗TRAF3抗体	CST	61095
抗K48连接多泛素抗体	CST	8081
HRP标记抗β-actin抗体	Santa Cruz	sc-1615-HRP
山羊抗小鼠IgG轻链特异性抗体	Jackson Immunoresearch	115-035-174
小鼠抗兔IgG轻链特异性抗体	Jackson Immunoresearch	211-032-171
Femto化学发光试剂	Thermo Scientific	34094
共免疫沉淀	EZview Red抗HA亲和凝胶	Sigma-Aldrich	E6779
抗Flag M2亲和凝胶	Sigma-Aldrich	A2220
EZview Red抗c-Myc亲和凝胶	Sigma-Aldrich	E6654
抗V5琼脂糖亲和凝胶	Sigma-Aldrich	A7345
Protein G Sepharose 4 Fast Flow珠	GE	17061801
泛素化实验	抗TBK1/NAK抗体	NOVUS	NB100-56705
流式细胞术	抗CD16/32抗体	Biolegend	101301
BV711抗CD11b抗体	Biolegend	101241
BV785抗Ly-6G抗体	Biolegend	127645
AF700抗Ly-6C抗体	Biolegend	128023
APC抗F4/80抗体	Biolegend	123115
PE/Cy7抗CD11c抗体	Biolegend	117317
BV650抗CD19抗体	Biolegend	115541
PE抗CD3抗体	Biolegend	100205
BV605抗CD45.2抗体	Biolegend	109841
FITC抗CD317抗体	Biolegend	127007
流式分选	FITC抗CD19抗体	Biolegend	152403
APC抗CD11b抗体	Biolegend	101211

实验环节

名称

品牌

货号

细胞刺激

聚肌胞苷酸

Invivogen

tlrl-pic

聚脱氧腺苷-脱氧胸苷

Invivogen

ttlrl-patn

5’三磷酸RNA

Invivogen

tlrl-3prna

脂质体2000

Thermo Scientific

11668027

脂质体LTX

Thermo Scientific

15338030

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因检测系统

Promega

E1910

质粒构建

pmCherry-N1载体

Takara

632523

siRNA敲低

对照siRNA

Origene

SR30004

TRAF3IP3 siRNA

Origene

SR312910A

TRAF3IP3 siRNA

Origene

SR312910C

慢病毒包装

pMD2.G包膜质粒

Addgene

12259

psPAX2包装质粒

Addgene

12260

慢病毒浓缩

慢病毒沉淀液

ALSTEM

VC100

CRISPR/Cas9敲除

lentiCRISPRv2载体

Addgene

52961

插入缺失频率检测

Guide-it突变检测试剂盒

Takara

631448

RNA提取与逆转录

TRIzol试剂

Thermo Scientific

15596026

iScript cDNA合成试剂盒

BIO-RAD

1708891

RT-qPCR

PowerUp SYBR Green预混液

Thermo Scientific

A25741

免疫荧光

抗IRF3抗体

CST

11904

AF546标记抗兔二抗

Thermo Scientific

A-11035

ELISA

LumiKine人IFN-β检测试剂盒

Invivogen

lumi-hifnb

抗IFN-β大鼠单克隆抗体

Santa Cruz

sc-57201

抗IFN-β兔多克隆抗体

R&D

32400-1

HRP标记山羊抗兔IgG

Cell Signaling

7074

免疫印迹

RIPA裂解液

Boston Bioproducts

BP-116TX

cOmplete蛋白酶抑制剂混合物

Sigma-Aldrich

11697498001

PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物

Sigma-Aldrich

4906845001

硝酸纤维素膜

BIO-RAD

1620112

抗磷酸化TBK1（Ser172）抗体

CST

5483

抗TBK1/NAK抗体

CST

3504

抗磷酸化IRF-3（Ser396）抗体

CST

4947

抗IRF-3抗体

CST

11904

抗磷酸化Stat1（Ser727）抗体

CST

9177

抗Stat1抗体

CST

9172

抗磷酸化p65（Ser536）抗体

CST

3033

抗p65抗体

CST

8242

抗磷酸化p38（Thr180/Tyr182）抗体

CST

9216

抗磷酸化Erk1/2（Thr202/Tyr204）抗体

CST

4370

抗磷酸化4E-BP1（Thr37/46）抗体

CST

2855

抗Flag抗体

CST

14793

抗HA抗体

CST

3724

抗Myc抗体

CST

2276

抗V5抗体

CST

13202

抗VSV-G标签抗体

GeneScript

A00199

抗TRAF3IP3抗体

Santa Cruz

sc-366384

抗cGAS抗体

CST

15102

抗STING抗体

CST

13647

抗TRAF3抗体

CST

61095

抗K48连接多泛素抗体

CST

8081

HRP标记抗β-actin抗体

Santa Cruz

sc-1615-HRP

山羊抗小鼠IgG轻链特异性抗体

Jackson Immunoresearch

115-035-174

小鼠抗兔IgG轻链特异性抗体

Jackson Immunoresearch

211-032-171

Femto化学发光试剂

Thermo Scientific

34094

共免疫沉淀

EZview Red抗HA亲和凝胶

Sigma-Aldrich

E6779

抗Flag M2亲和凝胶

Sigma-Aldrich

A2220

EZview Red抗c-Myc亲和凝胶

Sigma-Aldrich

E6654

抗V5琼脂糖亲和凝胶

Sigma-Aldrich

A7345

Protein G Sepharose 4 Fast Flow珠

17061801

泛素化实验

抗TBK1/NAK抗体

NOVUS

NB100-56705

流式细胞术

抗CD16/32抗体

Biolegend

101301

BV711抗CD11b抗体

Biolegend

101241

BV785抗Ly-6G抗体

Biolegend

127645

AF700抗Ly-6C抗体

Biolegend

128023

APC抗F4/80抗体

Biolegend

123115

PE/Cy7抗CD11c抗体

Biolegend

117317

BV650抗CD19抗体

Biolegend

115541

PE抗CD3抗体

Biolegend

100205

BV605抗CD45.2抗体

Biolegend

109841

FITC抗CD317抗体

Biolegend

127007

流式分选

FITC抗CD19抗体

Biolegend

152403

APC抗CD11b抗体

Biolegend

101211

环节	核对要点
细胞系及培养	HEK293T、HeLa、Vero、THP-1、Jurkat T、BJAB来源及培养基；BMDM采用含50% DMEM、20% FBS、30% L-929条件培养基分化5天阅读提示：Methods中Cell lines and virus小节
细胞刺激与病毒感染	poly(I:C)、poly(dA:dT)、5’ppp-RNA均为1 μg；VSV MOI及感染时间因实验而异（0.5、1或2）；脂质体种类为Lipofectamine 2000或LTX 阅读提示：Methods中Cell stimulation小节及图1、2、3图注
THP-1 CRISPR敲除	sgRNA序列见Supplementary Table 1；慢病毒转导后2 μg/ml嘌呤霉素筛选；Indel频率检测时间阅读提示：Methods中Lentivirus production、Indel frequency assay小节及Supplementary Table 1
小鼠模型与体内感染	Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+与Cre−小鼠8周龄、性别匹配；VSV 0.5×10^7 pfu/只腹腔注射；8 h采血、24 h取组织；生存分析n=10，细胞因子与病毒载量n=7 阅读提示：Methods中Animal husbandry、In vivo viral infection小节及图7图注
泛素化实验	HEK293T转染24 h；BMDM 8×10^6细胞、VSV MOI=1；1% SDS煮沸15 min后稀释10倍免疫沉淀阅读提示：Methods中Ubiquitination assay小节
统计学设计	双组用非配对t检验，多组用单因素或双因素ANOVA及相应事后检验，生存分析用Log-rank检验；显著性阈值p<0.05 阅读提示：Methods中Statistical analyses小节及图注

环节

核对要点

细胞系及培养

HEK293T、HeLa、Vero、THP-1、Jurkat T、BJAB来源及培养基；BMDM采用含50% DMEM、20% FBS、30% L-929条件培养基分化5天

阅读提示：Methods中Cell lines and virus小节

细胞刺激与病毒感染

poly(I:C)、poly(dA:dT)、5’ppp-RNA均为1 μg；VSV MOI及感染时间因实验而异（0.5、1或2）；脂质体种类为Lipofectamine 2000或LTX

阅读提示：Methods中Cell stimulation小节及图1、2、3图注

THP-1 CRISPR敲除

sgRNA序列见Supplementary Table 1；慢病毒转导后2 μg/ml嘌呤霉素筛选；Indel频率检测时间

阅读提示：Methods中Lentivirus production、Indel frequency assay小节及Supplementary Table 1

小鼠模型与体内感染

Traf3ip3fl/flLyz2-Cre+与Cre−小鼠8周龄、性别匹配；VSV 0.5×10^7 pfu/只腹腔注射；8 h采血、24 h取组织；生存分析n=10，细胞因子与病毒载量n=7

阅读提示：Methods中Animal husbandry、In vivo viral infection小节及图7图注

泛素化实验

HEK293T转染24 h；BMDM 8×10^6细胞、VSV MOI=1；1% SDS煮沸15 min后稀释10倍免疫沉淀

阅读提示：Methods中Ubiquitination assay小节

统计学设计

双组用非配对t检验，多组用单因素或双因素ANOVA及相应事后检验，生存分析用Log-rank检验；显著性阈值p<0.05

阅读提示：Methods中Statistical analyses小节及图注

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