构建合成细胞因子受体及合成配体
构建由GFP/mCherry纳米抗体与细胞因子受体胞内域融合的SyCyRs，以及GFP:mCherry融合配体。
将GVHH或CVHH分别与IL-23R、IL-12Rβ1、gp130的跨膜及胞内域融合；构建GFP-mCherry、2xGFP-mCherry、3xGFP等融合配体；通过逆转录病毒转导Ba/F3-gp130细胞并筛选稳定表达细胞系。
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合成细胞因子受体利用人工配体传递生物信号
Synthetic cytokine receptors transmit biological signals using artificial ligands.
实验完整度
高包含Ba/F3细胞系体外信号与增殖、小鼠肝脏体内水动力转染、基因芯片转录组及机制性反式磷酸化验证
主要模型
Ba/F3-gp130细胞系 U4C细胞 C57BL/6小鼠肝脏水动力转染模型
重点核对
合成配体GFP-mCherry、2xGFP-mCherry、3xGFP等的浓度及与HIL-23/HIL-6的平行比较 Ba/F3-SyCyR细胞系通过逆转录病毒转导并用嘌呤霉素和/或潮霉素B选择至少2周 western blot检测pSTAT3、pERK1/2、pAKT、pJAK1/2、pTYK2的刺激时间和上样蛋白量 小鼠尾静脉注射pcDNA3.1-GVHH-gp130（2.3 µg/只）和/或pcDNA3.1-3xGFP（1.28 µg/只）后24小时取样 基因芯片使用4个独立生物学重复，差异基因阈值1.5倍、p≤0.01
摘要
细胞因子诱导的信号转导由天然生物开关执行，这些开关在众多功能中控制免疫相关过程。在此，我们展示合成细胞因子受体（SyCyRs）可利用非生理性配体诱导细胞因子信号传导。高亲和力的GFP和mCherry纳米抗体分别融合到IL-6/IL-11和IL-23细胞因子受体gp130和IL-12Rβ1/IL-23R的跨膜和胞内结构域。同源和异源二聚体GFP:mCherry融合蛋白作为合成细胞因子样配体，能够在体外和体内诱导经典信号传导。使用SyCyR配体，我们证明IL-23受体同源二聚化导致其激活和IL-23样信号转导。此外，三聚体受体组装诱导具有相关Janus激酶的细胞因子受体间的反式磷酸化。SyCyR技术允许在体外和体内对跨膜受体信号进行生化分析，通过使用转基因动物的SyCyR配体实现细胞特异性激活，以及在免疫治疗中涉及非生理性靶点的可能治疗方案。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用非生理性配体（GFP/mCherry及其融合蛋白）通过合成细胞因子受体（SyCyRs）激活细胞因子信号，并解析受体组装模式对信号传导的影响？
- 核心机制
- GFP/mCherry纳米抗体融合到细胞因子受体胞内域后，合成配体诱导受体 homo/hetero 二聚化或三聚化，激活JAK-STAT、ERK和AKT通路；三聚体组装可在两条受体链间诱导STAT3反式磷酸化。
- 主要证据
- 在Ba/F3-SyCyR(IL-23/2A)、Ba/F3-SyCyR(IL-6)、Ba/F3-SyCyR(IL-23R)等细胞中，合成配体诱导增殖及JAK/STAT3/ERK/AKT磷酸化，转录组与天然细胞因子高度重叠；小鼠肝脏共表达GVHH-gp130与3xGFP后STAT3磷酸化和Saa1表达增加；异源三聚体SyCyR实验显示STAT3反式磷酸化。
- 研究意义
- SyCyR技术允许在体外和体内对跨膜受体信号进行生化分析，通过转基因动物实现细胞特异性激活，并可能开拓免疫治疗中涉及非生理性靶点的治疗方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证IL-23异源二聚体SyCyR信号
验证GFP-mCherry能否通过SyCyR(IL-23/2A)诱导IL-23样信号。
在Ba/F3-SyCyR(IL-23/2A)细胞中检测GFP-mCherry诱导的增殖及JAK、STAT3、ERK1/2、AKT磷酸化；与HIL-23刺激的Ba/F3-IL-12Rβ1-IL-23R细胞比较剂量依赖性和动力学；用可溶性GVHH-CVHH融合蛋白进行抑制实验。
转录组比较合成与天然IL-23信号
比较GFP-mCherry/SyCyR与HIL-23/天然受体诱导的基因表达谱。
对Ba/F3-SyCyR(IL-23/2A)和Ba/F3-IL-12Rβ1-IL-23R细胞分别用GFP-mCherry和HIL-23刺激后进行基因芯片分析，并用IPA进行通路分析。
验证IL-6同源二聚体SyCyR信号
验证多聚GFP配体能否通过GVHH-gp130同源二聚体诱导IL-6样信号。
在Ba/F3-SyCyR(IL-6)细胞中检测3xGFP诱导的JAK、TYK2、STAT3、ERK1/2磷酸化及增殖，并与HIL-6比较。
体内验证IL-6 SyCyR激活
验证SyCyR能否在小鼠肝脏中由合成配体激活。
通过尾静脉水动力注射pcDNA3.1-GVHH-gp130和/或pcDNA3.1-3xGFP，24小时后检测肝脏STAT3磷酸化、血清3xGFP及肝脏Saa1 mRNA表达。
验证IL-23R同源二聚体活性
验证IL-23R同源二聚体能否传递IL-23样信号。
在Ba/F3-SyCyR(IL-23R)细胞中检测3xGFP和2xGFP-mCherry诱导的增殖及JAK、STAT3、ERK1/2、AKT磷酸化，并进行基因芯片分析。
验证异源三聚体受体反式磷酸化
验证三聚体SyCyR组装能否在JAK缺陷受体与STAT缺陷受体间诱导STAT3反式磷酸化。
构建GVHH-IL-23R-ΔSTAT与CVHH-IL-23R-ΔJAK-A/B/C，以及GVHH-gp130-ΔSTAT与CVHH-IL-23R-ΔJAK-B组合，用2xGFP-mCherry诱导三聚体，检测STAT3磷酸化和细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO®, Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO®, Life Technologies | -- | |
| 青霉素 | Genaxxon Bioscience GmbH | -- | |
| 链霉素 | Genaxxon Bioscience GmbH | -- | |
| 转染 | TurboFect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Carl Roth | -- |
| 潮霉素B | Carl Roth | -- | |
| G-418硫酸盐 | Genaxxon, Biosciences | -- | |
| Western blot | 磷酸化STAT3 (Tyr705) (D3A7) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 |
| STAT3 (124H6) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr-202/Tyr-204) (D13.14.4E) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化AKT (Ser473) (D9E) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 磷酸化JAK1 (Tyr1022/1023) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3331 | |
| JAK1 (6G4) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3344S | |
| 磷酸化JAK2 (Tyr1007/1008) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3771 | |
| JAK2 (D2E12) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3230 | |
| 磷酸化TYK2 (Tyr1054/1055) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9321 | |
| TYK2 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9312 | |
| GFP (4B10) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2955 | |
| Western blot和流式细胞术 | myc (71D10) 单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 |
| Western blot | mCherry 单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31451 |
| Western blot和流式细胞术 | Flag (DYKDDDDK) 单克隆抗体 | Sigma Aldrich | F7425 |
| Western blot | γ-微管蛋白 单克隆抗体 | Sigma Aldrich | T5326 |
| 人CIS3/SOCS3 (C204) 单克隆抗体 | Immuno-Biological Laboratories Co, Ltd. | JP18391 | |
| β-肌动蛋白 (C4) 单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 过氧化物酶标记二抗 | Pierce (Thermo Fisher Scientific) | 31462 | |
| 过氧化物酶标记二抗 | Pierce (Thermo Fisher Scientific) | 31451 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 488标记的Fab山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A11070 |
| Western blot | PageRuler预染蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26616 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Blue细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| Infinite M200 PRO酶标仪 | Tecan | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce, Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck Chemicals GmbH | -- |
| ChemoCam成像仪 | INTAS Science Imaging Instruments GmbH | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 基因芯片 | Ambion WT表达试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| WT末端标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Affymetrix小鼠基因ST 1.0芯片 | Affymetrix | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Saa1引物 | Qiagen | QT00196623 | |
| 一步法SYBR试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 肝脏裂解 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂 | Roche Diagnostics | -- |
| 蛋白纯化 | cOmplete蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | -- |
| 流式分析 | BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SyCyR细胞系构建与筛选 | 逆转录病毒转导使用的pMOWS载体抗性、嘌呤霉素1.5 µg/ml和潮霉素B 1 mg/ml的选择时间至少2周 阅读提示：Methods中Transfection and selection of cells小节 |
| 合成配体刺激信号实验 | 不同配体的刺激浓度（如100 ng/ml）、刺激时间（20-60 min）及HIL-6/HIL-23对照浓度 阅读提示：Methods中Stimulation assays小节及Fig. 1-8图注 |
| 细胞增殖实验 | 每孔5×10^3细胞、培养3天、配体浓度范围0.1-1600 ng/ml、三个重复 阅读提示：Methods中Cell viability assay小节及Fig. 1b-d、Fig. 4d、Fig. 5b-c图注 |
| 小鼠体内水动力转染 | 8周龄雄性C57BL/6小鼠、pcDNA3.1-GVHH-gp130 2.3 µg/只、pcDNA3.1-3xGFP 1.28 µg/只、注射后24小时取样、每组动物数 阅读提示：Methods中Hydrodynamic-based in vivo gene delivery小节及Fig. 4f-h图注 |
| 基因芯片分析 | 刺激浓度100 ng/ml、刺激时间60 min、4个独立生物学重复、差异基因阈值1.5倍和p≤0.01 阅读提示：Methods中Microarray analysis小节及Fig. 3、Fig. 6图注 |