患者纳入与分组
比较有症状和无症状颈动脉粥样硬化患者的临床特征和淋巴结大小。
纳入106例重度颈动脉狭窄患者，分为症状组（42例）和无症状组（64例），记录基线数据和淋巴结直径。
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人颈动脉周围淋巴结的单细胞转录组学提示颈动脉粥样硬化斑块的稳定性
Single-Cell Transcriptomics of Human Pericarotid Lymph Nodes Indicating Stability of Carotid Atherosclerotic Plaques
实验完整度
高研究包含临床队列分析、斑块病理学评估、单细胞转录组及免疫组化、免疫荧光等多层次验证，并进行了功能富集和机制探讨。
主要模型
人颈动脉周围淋巴结 颈动脉粥样硬化斑块 颈动脉内膜切除术患者
重点核对
淋巴结肿大定义：横径≥10mm 症状性患者定义：6个月内发生一过性黑蒙、短暂性脑缺血发作或同侧缺血性卒中 单细胞测序样本：3个肿大淋巴结（来自3例有症状患者）和3个非肿大淋巴结（来自3例无症状患者） 细胞分群：淋巴细胞、髓系细胞、基质细胞 统计显著性：P<0.05
摘要
背景：淋巴结功能与动脉粥样硬化之间的联系尚不清楚，尤其是在单细胞水平。本研究利用单细胞转录组分析探讨颈动脉周围淋巴结与斑块稳定性之间的关系。方法：我们纳入了106例接受颈动脉内膜切除术的重度颈内动脉狭窄患者。我们记录了基线临床数据和颈动脉周围淋巴结大小，并分析斑块组成以评估其与淋巴结肿大的关联。使用单细胞转录组和T/B细胞受体测序对颈动脉周围淋巴结进行分析。结果：有症状的颈动脉粥样硬化患者有更多的颈动脉周围淋巴结肿大（P<0.001），表明斑块不稳定。其特点是炎症增加，CD68+巨噬细胞浸润增多（P<0.001），纤维含量减少（P<0.001）。单细胞分析确定了3个主要细胞区室：淋巴细胞、髓系细胞和基质细胞。肿大的淋巴结具有显著更多的初始B细胞和T细胞（P<0.001），表明免疫反应增强。巨噬细胞和中性粒细胞可能有助于胆固醇的转运和降解，而基质细胞可能通过影响T细胞耐受和淋巴细胞运输来调节免疫微环境。结论：颈动脉周围淋巴结肿大是斑块不稳定和近期缺血事件的潜在生物标志物。本研究提供了动脉粥样硬化中人淋巴结的综合单细胞转录组图谱。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 颈动脉周围淋巴结的状态是否与动脉粥样硬化斑块稳定性及临床症状相关，其细胞组成和功能在单细胞水平有何特征？
- 核心机制
- 肿大的颈动脉周围淋巴结内初始B细胞和T细胞比例增加，CD8+ T细胞和B细胞克隆扩增增强，巨噬细胞和中性粒细胞可能参与胆固醇转运和降解，基质细胞通过影响T细胞耐受和淋巴细胞运输调节免疫微环境。
- 主要证据
- 基于106例颈动脉内膜切除术患者的临床和病理分析，以及6例淋巴结的单细胞转录组和T/B细胞受体测序，发现肿大淋巴结与斑块炎症增加、CD68+巨噬细胞浸润增多、纤维含量减少相关。
- 研究意义
- 肿大的颈动脉周围淋巴结是斑块不稳定和近期缺血事件的潜在生物标志物，为动脉粥样硬化的免疫机制提供了新的见解，并可能提示未来的免疫治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
斑块病理学分析
评估肿大与非肿大淋巴结组间斑块组成差异。
对颈动脉斑块进行HE、天狼星红、Perls'普鲁士蓝染色和免疫组化染色，量化纤维组织、巨噬细胞、炎症因子等。
单细胞转录组测序
描绘颈动脉周围淋巴结的细胞组成和转录特征。
对6例淋巴结样本进行单细胞RNA测序，鉴定主要细胞类型和亚群。
单细胞T/B细胞受体测序
分析淋巴结内T和B细胞的克隆扩增情况。
对同一批样本进行TCR/BCR V(D)J测序，定义克隆型并比较扩增。
免疫荧光验证
验证淋巴结中巨噬细胞和中性粒细胞与脂质代谢相关蛋白的共定位。
对淋巴结切片进行免疫荧光染色，观察C1QA/APOE和S100A8/S100A9/LDLR/ox-LDL表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 组织消化 | gentleMACS组织解离器 | Miltenyi | -- |
| 细胞过滤 | 100微米细胞过滤器 | Miltenyi | -- |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Miltenyi | -- |
| 细胞分选 | 7-AAD染色 | eBioscience | -- |
| BD Melody分选仪 | Becton, Dickinson and Company | -- | |
| 细胞计数 | Countstar自动细胞计数仪 | ALIT Life Science | -- |
| 单细胞测序 | 10x Chromium单细胞V(D)J试剂盒1.1版 | 10x Genomics | -- |
| cDNA合成 | C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| cDNA纯化 | DynaBeads磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SPRIselect试剂 | Beckman Coulter | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 数据分析 | Cell Ranger分析流程6.1.2版 | 10x Genomics | -- |
| R软件4.1.2版 | R Foundation for Statistical Computing | -- | |
| Seurat包4.1.1版 | -- | -- | |
| clusterProfiler包4.2.2版 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗平滑肌α-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 14395-1-AP |
| 抗肿瘤坏死因子α抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| 抗白细胞介素1β抗体 | Proteintech | 16806-1-AP | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab213363 | |
| 抗CD3抗体 | Proteintech | 17617-1-AP | |
| 抗CD19抗体 | Proteintech | 66298-1-Ig | |
| 抗CD1C抗体 | Proteintech | 28838-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗C1QA抗体 | Abcam | ab189922 |
| 抗S100A8+S100A9抗体 | Abcam | ab288715 | |
| 抗载脂蛋白E抗体 | Abcam | ab183597 | |
| 抗低密度脂蛋白受体抗体 | Proteintech | 10785-1-AP | |
| 抗氧化低密度脂蛋白抗体 | Abcam | ab14519 | |
| 图像采集 | WS-10数字全景扫描仪 | Zhiyue | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者纳入与分组 | 纳入标准：颈动脉狭窄>70%；症状性定义：6个月内同侧缺血事件；排除标准：颈部肿瘤、放疗史、淋巴瘤、淋巴结结核 阅读提示：Methods 中的 Patient Selection and Clinical Data Collection |
| 淋巴结测量 | 淋巴结大小记录：纵径和横径；肿大定义：横径≥10mm 阅读提示：Methods 中的 Patient Selection and Clinical Data Collection |
| 斑块病理分析 | 染色方法：HE、天狼星红、DAB-enhanced Perls'普鲁士蓝、免疫组化；定量分析：ImageJ，阈值面积/病变面积；评估者：2名盲法研究者 阅读提示：Methods 中的 Plaque Pathological Analysis 和 Immunohistochemistry Staining |
| 单细胞测序 | 样本：6例淋巴结；细胞数：67,652；建库：10x Chromium V(D)J试剂盒；测序：NovaSeq 6000；分析：Cell Ranger 6.1.2，Seurat 4.1.1 阅读提示：Methods 中的 Single-Cell Library Construction and Sequencing 和 Single-Cell RNA Sequencing Data of Normal LNs |
| TCR/BCR测序 | 克隆型定义：TCR相同CDR3核苷酸序列和VDJC基因，BCR相同核苷酸序列和相应V基因；扩增克隆：>1细胞 阅读提示：Methods 中的 Single-Cell TCR/BCR Data Analysis |