体外细胞损伤模型建立与PE保护作用评估
评估PE对LPS+ATP诱导的H9c2细胞损伤的保护作用。
H9c2细胞经PE预处理后，使用LPS和ATP刺激，检测细胞活力、LDH释放、细胞死亡等。
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长梗冬青苷靶向P2X7R通过调控NLRP3/PIP2/MAPK信号通路保护心肌炎
Pedunculoside targets P2X7R to protect against myocarditis by regulating the NLRP3/PIP2/MAPK signaling pathway.
实验完整度
高包含体外LPS+ATP诱导H9c2细胞损伤模型、体内LPS诱导大鼠心肌炎模型，以及分子对接、CETSA、Co-IP等机制验证，功能验证和机制验证完整。
主要模型
H9c2大鼠心肌细胞系 LPS诱导的SD大鼠心肌炎模型
重点核对
PE纯度>98%（HPLC检测） 体外实验中PE预处理浓度（5、10、20 μM）及时间（4 h） LPS（1 μg/mL）刺激12 h，ATP（10 mM）刺激0.25 h或24 h 体内实验中PE给药剂量（10、20、40 mg/kg，尾静脉注射，连续5天）及LPS（8 mg/kg）腹腔注射18 h P2X7R抑制剂AZD9056使用浓度（5 μM）及预处理时间（1 h）
摘要
背景：心肌炎是由多种原因引起的心肌炎症，以心肌细胞坏死和间质炎性细胞浸润为主要表现。长梗冬青苷（PE）在炎症性疾病中发挥保护作用；然而，其对心肌炎的作用和机制尚未被探索。方法：在本研究中，我们利用LPS+ATP诱导的心肌细胞损伤模型和LPS诱导的大鼠心肌炎模型，在体内和体外评估了PE的心脏保护作用，并阐明了其潜在机制。结果：我们发现PE抑制了LPS+ATP诱导的H9c2细胞死亡，并降低了ROS、Ca2+水平和MMP损失。此外，PE改善了LPS诱导的心肌炎大鼠的心脏功能。机制上，PE抑制了与P2X7R相关的NLRP3炎症小体、PIP2和MAPK信号通路的激活。此外，PE干扰并减弱了P2X7R与PIP2之间的相互作用，显示出与P2X7R强烈的对接活性。结论：总之，PE通过与P2X7R相互作用并抑制NLRP3、PIP2和MAPK通路，表现出显著的抗心肌炎活性，突显其作为临床心肌炎治疗药物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 长梗冬青苷（PE）是否对心肌炎具有保护作用及其潜在分子机制。
- 核心机制
- PE通过结合P2X7R，抑制P2X7R与PIP2的相互作用，进而抑制NLRP3炎症小体、PIP2和MAPK信号通路的激活，发挥抗心肌炎作用。
- 主要证据
- 体外实验显示PE抑制LPS+ATP诱导的H9c2细胞死亡、ROS产生、Ca2+水平升高和MMP损失，并抑制NLRP3炎症小体及相关蛋白表达；分子对接和CETSA证实PE与P2X7R结合；体内实验显示PE改善LPS诱导大鼠心肌炎的心功能、减轻心肌损伤和炎症。
- 研究意义
- 首次发现P2X7R/NLRP3/IL-1β、PIP2和MAPK信号通路参与PE对心肌炎的调节作用，为心肌炎药物的开发和应用提供前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
氧化应激和线粒体功能检测
评估PE对LPS+ATP诱导的ROS产生和MMP损失的影响。
使用DCFH2-DA探针检测ROS水平，JC-1探针检测MMP。
NLRP3炎症小体激活检测
评估PE对LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体激活的抑制效果。
通过免疫荧光检测NLRP3、Caspase-1、ASC表达及EGFP-NLRP3转染实验，Western blot检测NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1、Cleaved-IL-1β蛋白水平。
P2X7R功能验证
验证P2X7R在LPS+ATP诱导心肌细胞损伤中的作用。
使用P2X7R抑制剂AZD9056处理细胞，检测细胞活力及NLRP3炎症小体通路蛋白表达。
PIP2信号通路检测
探讨P2X7R对PIP2信号通路的激活作用及PE的调节。
Western blot检测PIP2、DAG、IP3、PLCγ2蛋白表达，免疫荧光检测PIP2，Co-IP检测P2X7R与PIP2相互作用，流式检测Ca2+水平。
MAPK信号通路检测
评估PE对LPS+ATP诱导的MAPK通路激活的抑制作用。
Western blot检测p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38蛋白表达。
PE与P2X7R结合验证
验证PE与P2X7R的直接结合。
分子对接和CETSA实验。
体内大鼠心肌炎模型建立与PE疗效评估
评估PE对LPS诱导大鼠心肌炎的心脏保护作用。
SD大鼠尾静脉注射PE（10、20、40 mg/kg）连续5天，然后腹腔注射LPS（8 mg/kg）18 h，检测心电图、超声心动图、血液指标、心肌酶、炎症因子、组织病理等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 长梗冬青苷 | -- | -- |
| 细胞损伤诱导 | 脂多糖 | Beyotime | -- |
| 三磷酸腺苷 | Macklin | -- | |
| 细胞活力检测 | 噻唑蓝 | Sigma-Aldrich | -- |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| Ca2+检测 | Fluo-3 AM | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞凋亡检测 | Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | -- |
| Ca2+螯合 | 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞凋亡检测 | PE-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | -- |
| 线粒体膜电位检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白免疫沉淀 | Pierce Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| P2X7R抑制剂 | AZD9056 | MedChemExpress | -- |
| 炎症因子检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- | |
| 氧化应激指标检测 | SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 心肌酶检测 | CK-MB检测试剂盒 | Shanghai Enzyme Linked Biotechnology Co. LTD. | -- |
| 肝功能检测 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 抗体 | 抗P2X7R抗体 | Cell Signaling Technology | 13809 |
| 抗Cleaved-IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 63124 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 31202 | |
| 抗Cleaved Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 89332 | |
| 抗PLCγ2抗体 | Cell Signaling Technology | 3872 | |
| 抗IP3受体1抗体 | Cell Signaling Technology | 8568 | |
| 抗DAG脂肪酶α抗体 | Cell Signaling Technology | 13626 | |
| 抗p-JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9255 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗p-p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗兔IgG HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠IgG HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗NLRP3抗体 | Affinity Biosciences | DF7438 | |
| 抗ASC抗体 | Affinity Biosciences | DF6304 | |
| 抗Caspase-1抗体 | Abcam | ab1872 | |
| 抗PIP2抗体 | Senta | 53412 | |
| 细胞培养 | 青霉素/链霉素 | -- | -- |
| 荧光成像 | 山羊抗小鼠IgG Fluor 488偶联物 | -- | S0017 |
| 转染 | turboFect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 蛋白印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 细胞活力检测 | 酶标仪(SYNERGYH1) | BioTek | -- |
| 荧光成像 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞术 | FACSMelody流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| BD Pharmingen | BD Biosciences | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦激光显微镜 | Leica | -- |
| 蛋白质印迹成像 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 分子对接 | AutoDock4.2.6 | -- | -- |
| 分子对接可视化 | Pymol 2.1 | -- | -- |
| 动物实验 | 水合氯醛 | -- | -- |
| MyLabSix智能彩色超声诊断仪 | Esaote | -- | |
| 血液分析 | 迈瑞血液分析仪 | Mindray | -- |
| 组织匀浆 | 组织匀浆器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞处理 | PE浓度（5、10、20 μM）及预处理时间（4 h）；LPS（1 μg/mL）刺激12 h；ATP（10 mM）刺激0.25 h或24 h；细胞密度（96孔板4×10³/孔，6孔板1×10⁵/孔，12孔板5×10⁴/孔） 阅读提示：见Methods 2.3-2.7 |
| P2X7R抑制实验 | AZD9056浓度（5 μM）及预处理时间（1 h）；LPS（1 μg/mL）12 h；ATP（10 mM）24 h 阅读提示：见Methods 2.3和Results 3.4 |
| 动物模型 | SD大鼠（220-250 g）；分组及样本量（每组10只）；PE剂量（10、20、40 mg/kg）尾静脉注射连续5天；LPS剂量（8 mg/kg）腹腔注射18 h；麻醉（10%水合氯醛4 mL/kg） 阅读提示：见Methods 2.13-2.15 |
| Western blot | 蛋白上样量（细胞20 μg，组织30 μg）；抗体稀释比例（1:1000）；抗体来源及货号 阅读提示：见Methods 2.9 |
| 分子对接 | P2X7R结构（UniProt ID: Q99572）；结合能阈值（≤−5.0 kJ/mol）；软件（AutoDock4.2.6） 阅读提示：见Methods 2.11 |