构建ISG15敲除及回复细胞系
验证ISGylation在体内肺癌模型中对STING激动剂反应的影响
在LLC细胞中敲除ISG15，并回复表达ISG15-WT或非ISGylatable突变体ISG15-C2，然后植入C57BL/6小鼠，用diABZi处理
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ISGylation阻止STING的自噬降解并促进肺癌抗肿瘤免疫
ISGylation prevents autophagic degradation of STING and promotes antitumor immunity in lung cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、H1299、LLC）、体内小鼠模型（LLC皮下移植瘤）、患者样本（组织芯片）及药物筛选，多层级功能与机制验证。
主要模型
H1299人非小细胞肺癌细胞系 LLC小鼠Lewis肺癌细胞系 C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型 肺癌患者组织芯片
重点核对
STING ISGylation位点：K236、K338、K347、K370 ISG15-C2非ISGylatable突变体的使用 USP18作为去ISG化酶的活性依赖性（C64S突变体对照） TST对USP18的抑制活性（IC50=3.41 µM）及体内剂量 体内实验使用diABZi（3 mg/kg，每3天静脉注射）
摘要
STING通路在免疫激活中发挥核心作用；然而，在包括肺癌在内的多种癌症进展过程中，STING蛋白水平下降，从而限制了免疫疗法的疗效。我们的研究揭示了一种先前未被认识的机制，即ISGylation通过阻止STING的自噬降解来稳定STING，从而增强其免疫刺激功能。此外，我们证明USP18是去除STING上ISGylation的负调控因子，并鉴定出丹参酮IIA磺酸钠（TST）是一种有效的USP18抑制剂，可增强STING的ISGylation并稳定STING蛋白水平。当与STING激动剂diABZi联合使用时，TST表现出协同效应，通过增加NK1.1⁺细胞的浸润和显著抑制肺癌模型中的肿瘤生长，引发强效的抗肿瘤免疫反应。这些发现强调了靶向STING ISGylation的治疗潜力，特别是在STING表达低、目前对STING靶向疗法反应不佳的患者中。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ISGylation是否通过调节STING蛋白稳定性来影响肺癌中的抗肿瘤免疫，以及能否通过靶向去ISG化酶USP18进行干预。
- 核心机制
- ISGylation在STING的K236、K338、K347和K370位点修饰，通过阻碍p62和LC3与STING的相互作用，抑制STING的自噬降解，从而维持STING蛋白稳定性并增强I型干扰素产生。USP18反向去除该修饰，使STING易被自噬降解。
- 主要证据
- 体外ISGylation实验显示HERC5增强STING ISGylation，USP18去除该修饰；STING-4KR突变加速蛋白降解、增强与p62/LC3结合、降低IFN-β水平；体内实验中STING-4KR肿瘤生长加快，肿瘤浸润NK1.1+和CD8+ T细胞显著减少；TST抑制USP18并增强STING稳定性，联合diABZi抑制肿瘤生长
- 研究意义
- 为STING表达低的肺癌患者提供一种潜在的联合治疗策略，通过TST抑制USP18恢复STING ISGylation，增强STING激动剂的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定STING的ISGylation位点
确定介导STING稳定性调控的关键赖氨酸残基
在HEK293T细胞中共表达STING、E1、E2和各种E3连接酶，筛选增强ISGylation的E3；通过构建STING-K0和单个赖氨酸回复突变体，检测各残基的ISGylation及对蛋白稳定性的影响
验证ISGylation对STING降解途径的影响
区分ISGylation是抑制自噬还是蛋白酶体途径的降解
使用自噬抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG132处理，检测STING蛋白水平变化；通过免疫共沉淀检测STING与p62/LC3的相互作用；使用共聚焦显微镜观察STING与LC3的共定位
评估STING ISGylation对体内抗肿瘤免疫的影响
验证STING四突变（4KR）导致的ISGylation缺失是否影响肿瘤生长和免疫浸润
将表达STING-WT或STING-4KR的LLC细胞植入C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞
分析患者样本中USP18与STING的相关性
探讨USP18表达与STING水平及患者预后的临床关联
使用TCGA数据库进行Kaplan-Meier生存分析；对60对肺癌和癌旁组织进行IHC染色，评估USP18和STING表达并进行相关性分析
筛选并验证USP18抑制剂TST
鉴定能够稳定STING的小分子USP18抑制剂，并验证其增强STING ISGylation和抗肿瘤作用
通过FRET-based酶学筛选17,280个小分子，获得TST；通过NMR-STD验证直接结合；细胞实验中检测TST对STING ISGylation和蛋白稳定性的影响；体内实验评估TST单用及与diABZi联用的抗肿瘤效果
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| RPMI 1640培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | Yeasen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Basal media | -- | |
| 非必需氨基酸溶液 | Basal media | -- | |
| HEPES | Solarbio | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 2.0 发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9241 |
| 转染 | Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | 40802 |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 |
| 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 18583 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗ISG15抗体 | Invitrogen | 7H29L24 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗pIRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 79945 | |
| 抗LC3I/II抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 | |
| 抗p62抗体 | Cell Signaling Technology | 39749 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 20326 | |
| 抗K48-泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗兔IgG-HRP二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠IgG-HRP二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45-FITC抗体 | BioLegend | 103107 |
| 抗小鼠CD8a-APC抗体 | BioLegend | 100711 | |
| 抗小鼠NK1.1-PE抗体 | BioLegend | 156503 | |
| 药物处理 | diABZi | Selleck | S8796 |
| 丹参酮IIA磺酸钠 | Yeasen | 54516ES20 | |
| MG132 | Topscience | T2154 | |
| 氯喹 | Cell Signaling Technology | 14774 | |
| 蛋白质印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Diagnostics | 5892791001 |
| ExpressPlus PAGE凝胶，4-20% | GenScript | M00657 | |
| eBlot-L1系统 | GenScript | L00686 | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| RT-qPCR | TRIeasy总RNA提取试剂 | Yeasen | 19221ES60 |
| Hifair II第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11119ES60 | |
| Hieff qPCR SYBR绿色预混液（无Rox） | Yeasen | 11201ES08 | |
| 免疫荧光 | 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 |
| 抗LC3I/II抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 | |
| 荧光标记二抗 | Beyotime | A0468/A0423 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | A1R | |
| 稳定细胞系构建 | pSPAX2 | Addgene | 12260 |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 |
| ELISA | 人/小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0033L |
| 流式细胞术 | 胶原酶D | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 透明质酸酶 | Yeasen | 20426ES60 | |
| DNA酶I | Yeasen | 10608ES25 | |
| 红细胞裂解液 | Yeasen | 40401ES60 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 组织芯片和免疫组化 | 肺癌组织芯片 | Biotechwell | ZL-LUC1601 |
| 免疫组化 | 抗USP18抗体 | Thermo Fisher | PA5-110555 |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抑制剂筛选 | 肽-AMC底物 | Bachem Bioscience | 4027158 |
| 384孔黑色非结合板 | Corning | 3575 | |
| NMR-STD | Bruker Avance III-600 MHz谱仪 | Bruker Biospin | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外ISGylation实验 | 细胞系（HEK293T）、转染质粒（Flag-STING、UBE1L、UBCH8、HERC5、Myc-ISG15）、处理时间（24小时）、检测方法（免疫沉淀后Western blot） 阅读提示：参见Materials and methods中“ISGylation and ubiquitination”部分及图2图注 |
| 体内肺癌模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、细胞系（LLC）、细胞接种量（5×10^6）、药物剂量（diABZi 3 mg/kg，TST 2.5/5/10 mg/kg）、给药途径（静脉注射）、给药频率（每3天）、肿瘤采集时间（第14天） 阅读提示：参见Materials and methods中“Xenograft animal model”部分及图1、图6图注 |
| 免疫细胞分析 | 流式抗体（CD45-FITC、CD8a-APC、NK1.1-PE）、组织消化酶（胶原酶D 1 mg/mL、透明质酸酶0.2 mg/mL、DNase I 0.1 mg/mL）、染色时间（室温20分钟） 阅读提示：参见Materials and methods中“Flow cytometry”部分及图1、4、6图注 |
| 蛋白质稳定性检测 | CHX浓度（100 µg/mL或50 µg/mL）、处理时间点、TST预处理浓度（50 µM）和时间（12小时） 阅读提示：参见Materials and methods中“Protein stability assay”部分及图6D,E图注 |