Salvianolic Acid B Attenuates Liver Fibrosis via Suppression of Glycolysis-Dependent m1 Macrophage Polarization.
包含体外细胞实验（RAW264.7巨噬细胞）和体内动物模型（CCl4诱导的肝纤维化小鼠），并通过分子机制验证（MIG1、DNMT1、糖酵解通路）支持结论。
C57BL/6小鼠CCl4诱导的肝纤维化模型 LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞
小鼠分组：对照、CCl4模型、SAL B低/中/高剂量（10、20、40 mg/kg，每日灌胃，共42天） CCl4注射：皮下注射10% CCl4（玉米油溶解），剂量0.1 mL/10g体重，每周三次，共6周 细胞处理：RAW264.7细胞用1 μg/mL LPS和不同浓度SAL B（1、5、10 μM）处理24小时 关键检测：血清及组织ALT、AST、Hyp水平，肝组织及细胞中M1/M2标志物（INOS/ARG-1、Cd86/Cd206）、糖酵解酶（HK2、LDHA）、MIG1表达 机制验证：MIG1抑制剂MSC1094308和糖酵解抑制剂2-DG的使用
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SAL B对CCl4诱导肝纤维化的保护作用。
雄性C57BL/6小鼠随机分为6组（每组10只）：对照组、CCl4模型组、SAL B低/中/高剂量组（10、20、40 mg/kg，灌胃）。除对照组外，所有组皮下注射10% CCl4（溶于玉米油，0.1 mL/10g体重），每周三次，持续6周；同时每日灌胃SAL B或等量生理盐水，共42天。通过血清生化检测（ALT、AST、Hyp）、肝组织Western blot（α-SMA）、组织学染色（H&E、Masson、Sirius red）评估肝损伤和纤维化程度。
探究SAL B在体内对巨噬细胞M1/M2极化和糖酵解水平的作用。
采用qRT-PCR检测肝组织中M1标志物Cd86和M2标志物Cd206的mRNA表达；Western blot检测INOS、ARG-1、HK2、LDHA和MIG1蛋白表达；Griess法检测NO水平；ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
验证SAL B在体外对LPS诱导的巨噬细胞M1极化和炎症反应的抑制作用。
RAW264.7细胞用1 μg/mL LPS和不同浓度SAL B（1、5、10 μM）处理24小时。通过CCK8实验确定无细胞毒性剂量；检测NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平；Western blot检测INOS和ARG-1表达。
确定SAL B对巨噬细胞糖酵解的抑制作用及其与抗炎效应的因果关系。
检测乳酸分泌、ATP水平和NAD+/NADH比值；测量HK和LDHA酶活性；Western blot检测HK2和LDHA蛋白表达；使用糖酵解抑制剂2-DG联合SAL B处理，观察对NO和促炎细胞因子释放的协同抑制作用。
证明MIG1是SAL B调节巨噬细胞糖酵解和炎症的关键靶点。
qRT-PCR和Western blot检测MIG1表达；使用MIG1抑制剂MSC1094308联合SAL B处理，检测糖酵解参数（ATP、NAD+/NADH、乳酸、HK/LDHA酶活性及蛋白表达）和炎症因子（NO、IL-1β、IL-6、TNF-α）的变化。
阐明SAL B上调MIG1表达的分子机制。
Western blot检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表达；分子对接模拟SAL B与DNMT1的结合模式；使用亚硫酸氢盐转化法检测MIG1启动子甲基化水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 丹酚酸B | Chengdu Push Biotechnology | 121521-90-2 |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MedChemExpress | HY-13966 | |
| MSC1094308 | MedChemExpress | HY-123872 | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 |
| 生化检测 | ATP检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A095-1-1 |
| 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A019-2-1 | |
| NAD+/NADH检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0175 | |
| AST/GOT活性检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K236-M | |
| ALT/GPT活性检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K235-M | |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K062-S | |
| Western blot | 抗α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP |
| 抗MIG1抗体 | Proteintech | 17673-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗LDHA抗体 | Proteintech | 19987-1-AP | |
| 抗HK2抗体 | Proteintech | 22029-1-AP | |
| 抗ARG-1抗体 | Proteintech | 16001-AP | |
| 抗INOS抗体 | Proteintech | 18985-1-AP | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | MULTISCIENCES | EK201BHS |
| IL-6 ELISA试剂盒 | MULTISCIENCES | EK206HS | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | MULTISCIENCES | EK282HS | |
| 细胞培养 | RAW264.7细胞 | Pri-cell | CL-0190 |
| 专用培养基（CM-0190） | Pri-cell | CM-0190 | |
| qRT-PCR | Simgen血液/培养细胞DNA提取试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| qRT-PCR | ABI7500实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| DNA甲基化检测 | DNA甲基化极端修饰试剂盒 | -- | -- |
| 数据分析 | Prism 9.5软件 | GraphPad Software | -- |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 分子对接 | Autodock Vina 1.1.2软件 | -- | -- |
| PyMOL 2.5.0软件 | Schrödinger | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；CCl4剂量、溶剂、注射途径、频率、持续时间；SAL B剂量、给药途径、频率、持续时间；对照组处理 阅读提示：参见 Methods 2.3 Animal Experiments 及 Results 3.1 |
| 细胞培养与处理 | RAW264.7细胞来源及培养基；细胞密度、培养条件；LPS浓度、处理时间；SAL B浓度、处理时间；细胞活力检测（CCK8） 阅读提示：参见 Methods 2.2 Cell Culture 及 Results 3.3 |
| 分子检测 | 用于Western blot、qRT-PCR、ELISA的抗体、引物、试剂盒；蛋白/基因表达定量方法；内参基因；检测指标（如INOS、ARG-1、HK2、LDHA、MIG1、DNMT1等） 阅读提示：参见 Methods 2.6, 2.7 及 Results 各节 |
| 机制验证 | 2-DG和MSC1094308的使用浓度、处理时间、联合处理方式；DNA甲基化检测方法；分子对接参数 阅读提示：参见 Methods 2.8, 2.9 及 Results 3.4, 3.5, 3.6 |
