构建心肌细胞特异性Cdc42敲除小鼠
验证Cdc42在心脏中的功能缺失是否影响基础心脏功能。
将Cdc42loxP/loxP小鼠与MLC2v-Cre小鼠杂交，得到Cdc42CKO小鼠，通过RT-PCR、Western blot确认Cdc42敲除效率，并检测基础心功能。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
细胞分裂周期蛋白42驱动的MKK3/6-p38信号通路激活参与小鼠心脏重塑
Cell division cycle protein 42-driven activation of the MKK3/6-p38 signaling pathway participates in cardiac remodeling in mice.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、细胞实验（原代心肌细胞和H9c2细胞）、功能验证（超声、组织学）及机制验证（Western blot、RNA-seq）。
主要模型
Cdc42CKO小鼠（Cdc42loxP/loxP与MLC2v-Cre杂交） Cdc42loxP/loxP小鼠（对照） 成年小鼠心肌细胞 新生小鼠心肌细胞 H9c2细胞
重点核对
AngII剂量1500 ng/kg/min，皮下输注7天 TAC手术2或8周 AngII处理浓度1000 ng/ml，15分钟（原代细胞）或200 nM，24小时（H9c2） Cdc42抑制剂ML141（2 μM）和p38抑制剂SB203580（1 μM）预处理30分钟 检测MKK3/6、p38磷酸化水平（Western blot）
摘要
细胞分裂周期蛋白42（Cdc42）是Rho GTPase亚家族的成员，作为细胞周期分裂、细胞骨架排列、细胞极化、膜运输和信号转导中的信号介导因子。然而，Cdc42在心脏重塑（包括肥大和纤维化）中的作用仍存在争议。本研究旨在阐明Cdc42在心脏重塑中的作用及其潜在机制。通过将Cdc42loxP/loxP小鼠与MLC2v-Cre小鼠杂交，生成心脏Cdc42敲除（Cdc42CKO）小鼠。通过皮下给予AngII（1500 ng/kg/min）7天或横向主动脉缩窄（TAC）2或8周诱导小鼠心脏重塑模型。我们的结果表明，心脏Cdc42缺失显著抑制了AngII或TAC诱导的心脏肥大和纤维化，并改善了小鼠的心脏功能。Cdc42CKO或特异性抑制Cdc42，显著抑制了Ang II介导的心脏和分离的新生/成年小鼠心肌细胞或H9c2细胞中MKK3/6-p38级联的激活。此外，Cdc42过表达增加了心肌细胞的表面积和肥大基因表达，而ML141（一种Cdc42抑制剂）和SB203580（一种p38抑制剂）特异性降低了Cdc42过表达或AngII诱导的肥大心肌细胞中p38激活和肥大，表明p38是Cdc42在心脏肥大中的下游效应因子。总之，我们的结果表明Cdc42通过激活p38信号通路是心脏重塑的关键驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Cdc42在心脏重塑（心肌肥大和纤维化）中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- Cdc42通过激活MKK3/6-p38信号通路促进心脏肥大和纤维化。
- 主要证据
- 利用心肌细胞特异性Cdc42敲除小鼠模型，结合AngII输注和TAC手术，通过超声心动图、组织学染色、Western blot和RNA-seq等发现Cdc42缺失抑制p38磷酸化并减轻心脏肥大和纤维化；在体外，Cdc42过表达促进心肌细胞肥大，而抑制Cdc42或p38可逆转此效应。
- 研究意义
- 揭示Cdc42作为心脏重塑的关键驱动因素，为理解心脏肥大和重塑机制提供新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AngII输注诱导心脏重塑模型
评估Cdc42缺失对AngII诱导的心脏肥大和纤维化的影响。
对Cdc42CKO和Cdc42loxP/loxP小鼠皮下输注AngII（1500 ng/kg/min）7天，通过超声心动图、组织学染色评估心脏结构和功能变化。
TAC手术诱导压力超负荷模型
评估Cdc42缺失对TAC诱导的心脏重塑的影响。
对Cdc42CKO和Cdc42loxP/loxP小鼠进行微创TAC手术，持续2或8周，通过超声心动图、组织学染色评估心脏重塑程度。
体外心肌细胞实验验证Cdc42-p38通路
验证Cdc42在心肌细胞肥大中是否通过p38信号通路发挥作用。
分离成年和新生小鼠心肌细胞及H9c2细胞，进行AngII刺激或Cdc42过表达，并给予Cdc42抑制剂ML141或p38抑制剂SB203580，检测细胞表面积、肥大基因表达和p38磷酸化。
机制探究：检测信号通路活性
明确Cdc42缺失对MAPK、PI3K/Akt等信号通路的影响。
通过Western blot检测心脏组织和心肌细胞中相关信号蛋白的磷酸化水平，如MKK3/6、p38、ERK、JNK、PI3K、Akt等，并进行RNA-seq分析差异表达基因。
凋亡和炎症检测
评估Cdc42缺失对TAC诱导的心肌细胞凋亡和炎症因子分泌的影响。
通过TUNEL染色检测TAC 2周心肌凋亡，通过ELISA或免疫荧光检测血清和细胞中IL-6、TNF-α水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | Alzet渗透压迷你泵 | Alzet | 1007D |
| 血管紧张素II | -- | -- | |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 组织学 | Masson三色染色 | Solarbio | G1340 |
| 细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS0004176 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 27250-018 | |
| II型胶原酶 | Sigma | C6885 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 11965092 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 5-溴-2-脱氧尿苷 | Sigma | B5002 | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher | 15140163 | |
| 细胞系 | H9c2细胞 | ATCC | CRL-1446™ |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 抗Cdc42抗体 | Santa Cruz | sc-8401 | |
| 抗RhoA抗体 | Abcam | ab187027 | |
| 抗ERK1/2抗体 | CST | 4695 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | CST | 4370 | |
| 抗JNK抗体 | Abcam | ab179461 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Abcam | ab124956 | |
| 抗NF-κB/p65抗体 | Abcam | ab16502 | |
| 抗磷酸化NF-κB/p65抗体 | Abcam | ab86299 | |
| 抗CaMKII抗体 | Abcam | ab32422 | |
| 抗磷酸化CaMKII抗体 | Millipore | 05-574 | |
| 抗NFAT-C4抗体 | Abcam | ab23672 | |
| 抗钙调磷酸酶抗体 | Abcam | ab18932 | |
| 抗p38抗体 | Abcam | ab170099 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Abcam | ab4822 | |
| 抗磷酸化MKK3/MKK6抗体 | CST | 9231 | |
| 抗GSK3β抗体 | CST | 9315 | |
| 抗磷酸化GSK3β抗体 | CST | 9336 | |
| 抗AKT1抗体 | CST | 2967 | |
| 抗磷酸化AKT1抗体 | CST | 4060 | |
| 抗PI3K抗体 | CST | 4257 | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | CST | 4228 | |
| 抗IL6抗体 | CST | 12912 | |
| 抗TNFα抗体 | Proteintech | 60298-1-Ig | |
| 抗IL10抗体 | Proteintech | 10008-1-AP | |
| 抗Col1抗体 | Servicebio | GB11013 | |
| 抗ANP抗体 | Santa Cruz | sc-515701 | |
| 抗BNP抗体 | Abcam | ab19645 | |
| 抗Col3抗体 | Servicebio | GB11015 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-47724 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Invitrogen | A16078 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Invitrogen | A28175 | |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | 9109 |
| Superscript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080051 | |
| RT-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | -- | -- |
| RNA-seq | NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530L |
| AMPure XP系统 | Beckman Coulter | A63880 | |
| USER酶 | NEB | M5505L | |
| TruSeq PE簇生成试剂盒v3-cBot-HS | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化p38抗体 | CST | 4511 |
| 抗IL-6抗体 | CST | 12912 | |
| 荧光素标记二抗 | Proteintech | SA00013-4 | |
| 荧光素标记二抗 | Proteintech | SA00013-1 | |
| DAPI | Santa Cruz | sc-24941 | |
| 蔡司LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| TUNEL | 一步法TUNEL原位凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-321 |
| 小鼠模型 | 尾袖血压测量系统 | Softron | BP-98 |
| 动物手术 | 啮齿动物呼吸机 | ALC-VBS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | Cdc42loxP/loxP和MLC2v-Cre小鼠的背景（C57BL/6）及杂交策略；AngII剂量（1500 ng/kg/min）和输注时间（7天）；TAC手术持续时间（2或8周）。 阅读提示：见Materials and methods中的Animal models部分 |
| 超声心动图 | 麻醉方式（1.5-2%异氟烷）及测量参数（LV mass, EF, FS等）；测量时间点（AngII第7天、TAC第2或8周）。 阅读提示：见Materials and methods中的Echocardiography部分 |
| 组织学分析 | 心脏固定（4%多聚甲醛24小时）、石蜡包埋、切片厚度（5μm）；H&E和Masson三色染色步骤。 阅读提示：见Materials and methods中的Histology部分 |
| 细胞分离与培养 | 成年小鼠心肌细胞分离时使用的胶原酶浓度（15,000 U总II型胶原酶）和消化时间（10-12分钟）；新生小鼠心肌细胞分离时使用的胰蛋白酶和胶原酶浓度；培养条件（DMEM、10% FBS、37°C、5% CO2）。 阅读提示：见Materials and methods中的Isolation and culture of cardiomyocytes部分 |
| 细胞处理 | AngII浓度（原代细胞1000 ng/ml处理15分钟，H9c2细胞200 nM处理24小时）；Cdc42抑制剂ML141（2 μM）和p38抑制剂SB203580（1 μM）预处理30分钟。 阅读提示：见Figure 3和Figure 4的图注 |
| Western blot | 蛋白提取使用RIPA缓冲液；抗体列表和稀释度（如anti-Cdc42, anti-p38等）；内参（GAPDH）。 阅读提示：见Materials and methods中的Western blot analysis部分 |
| RNA提取与qPCR | RNA提取使用TRIzol；cDNA合成使用Superscript III；qPCR引物序列和反应条件（SYBR Green）。 阅读提示：见Materials and methods中的RNA extraction, transcriptome assembly and real-time PCR部分 |
| RNA-seq | RNA-seq建库试剂盒（NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina）、测序平台（Illumina HiSeq）、数据量（约6 Gb/样本）、差异表达分析（DESeq）。 阅读提示：见Materials and methods中的RNA extraction, transcriptome assembly and real-time PCR部分 |
| TUNEL凋亡检测 | TUNEL试剂盒（One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit）和操作步骤（蛋白酶K处理、TUNEL反应混合液孵育1小时）。 阅读提示：见Materials and methods中的TUNEL assay部分 |
| 统计分析 | 数据表示（mean ± SD）；两组比较使用Student's t检验；多组比较使用ANOVA（单因素或双因素），P<0.05为显著。 阅读提示：见Materials and methods中的Statistical analysis部分 |