miR-124-3p通过靶向ITGB1抑制结直肠癌的增殖、迁移和侵袭

miR-124-3p inhibits CRC proliferation, migration, and invasion by targeting ITGB1.

作者信息Jing Li, Lisi Liu
PMID39934532
发布时间2025-02-11
DOI10.1007/s12672-025-01936-2

实验完整度

包括组织样本分析、细胞功能实验、双荧光素酶报告基因和拯救实验等多个独立证据层级,并包含功能验证和机制验证。

主要模型

SW620细胞 HT29细胞 HCT116细胞 FHC细胞

重点核对

miR-124-3p mimics和inhibitor的转染效率(RT-qPCR验证) ITGB1作为miR-124-3p直接靶点的双荧光素酶报告基因实验 miR-124-3p对CRC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 ITGB1过表达对miR-124-3p抑制作用的拯救效果 Wnt/β-catenin通路蛋白(Wnt1和β-catenin)表达的变化

摘要

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见的癌症相关死亡原因。miR-124-3p已被广泛认为在多种恶性肿瘤中作为肿瘤抑制因子发挥关键作用。在本研究中,我们旨在探讨miR-124-3p在CRC细胞增殖、迁移和侵袭中的具体功能和潜在机制。通过一系列综合分析,包括CCK-8、集落形成、划痕愈合实验、流式细胞术、RT-qPCR和Western blotting,评估了miR-124-3p表达对CRC细胞生长的影响。通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验,研究了miR-124-3p及其潜在靶基因ITGB1的关系。为进一步巩固我们的发现,进行了拯救实验以验证miR-124-3p在调节CRC细胞增殖、迁移和凋亡中的作用,同时检测了涉及Wnt/β-catenin信号通路的基因。我们的研究表明,miR-124-3p的过表达显著抑制了CRC细胞的增殖和迁移能力,而其下调则产生相反的效果。值得注意的是,ITGB1被鉴定为miR-124-3p的推定靶基因,与miR-124-3p的表达水平呈负相关。此外,ITGB1的过表达能够消除miR-124-3p过表达对CRC细胞增殖、迁移以及Wnt1/β-catenin蛋白水平的抑制作用。我们的结果表明,miR-124-3p靶向ITGB1调节CRC细胞增殖和迁移可能涉及Wnt/β-catenin信号通路。这些发现提示miR-124-3p/ITGB1轴可能成为CRC治疗的潜在靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
miR-124-3p是否通过靶向ITGB1调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭?
核心机制
miR-124-3p通过直接靶向ITGB1并抑制其表达,进而下调Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。
主要证据
CRC组织和细胞系中miR-124-3p表达下调,与ITGB1表达呈负相关;双荧光素酶报告实验证实ITGB1为直接靶点;功能实验显示miR-124-3p过表达抑制增殖、迁移和侵袭,而ITGB1过表达逆转这些效应并恢复Wnt1和β-catenin蛋白水平。
研究意义
研究表明miR-124-3p/ITGB1轴可能成为结直肠癌诊断和治疗的潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测miR-124-3p在CRC组织和细胞中的表达

明确miR-124-3p在结直肠癌中的表达情况。

收集15对CRC组织和癌旁组织,通过RT-qPCR检测miR-124-3p表达;同时检测CRC细胞系(SW620、HT29、HCT116)和正常结肠黏膜细胞(FHC)中的表达水平。

2

观察miR-124-3p对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响

验证miR-124-3p对CRC细胞恶性行为的影响。

在SW620和HT29细胞中分别转染miR-124-3p mimics、inhibitor及其阴性对照,通过CCK-8、集落形成、划痕愈合和Transwell侵袭实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。

3

预测并验证ITGB1为miR-124-3p的直接靶基因

确定miR-124-3p是否直接调控ITGB1。

通过TargetScan和生物信息学分析预测miR-124-3p与ITGB1的结合位点,并利用双荧光素酶报告基因实验验证其直接结合。同时检测miR-124-3p表达变化对ITGB1 mRNA和蛋白水平的影响。

4

验证ITGB1过表达对miR-124-3p抑制作用的拯救效果

证明miR-124-3p的功能依赖于靶向ITGB1。

在SW620和HT29细胞中共转染miR-124-3p mimics和ITGB1过表达质粒,检测细胞增殖、集落形成、迁移和凋亡的变化,并通过Western blot检测Wnt1和β-catenin蛋白水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
ITGB1抗体ProteinTech12594-1-AP
高糖DMEM培养基GibcoC11995500BT
胎牛血清Gibco10270-106
青霉素/链霉素----
Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen11668-019
CCK-8试剂SolarbioCA1210
结晶紫SolarbioC8470
基质胶----
annexin V-APC/PI双染试剂盒ElabscienceE-CK-A151
流式细胞仪Sysmex PartecCyFlow
TRIzol试剂Invitrogen1596-026
RNAmisi microRNA提取试剂盒AidlabRN0501
RevertAid第一链cDNA合成试剂盒FermentasK1622
miRNA第一链合成试剂盒AidlabPC4801
Eastep qPCR master mix试剂盒PromegaLS2062
PrimeScript RT试剂盒TakaraRR036Q
ABI 7500实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
RIPA裂解液SolarbioR0020
BCA蛋白定量试剂盒SolarbioPC0020
PVDF膜MilliporeIPVH00010
ITGB1抗体ProteinTech12594-1-AP
Wnt1抗体ProteinTech27935-1-AP
β-catenin抗体ProteinTech80488-1-RR
β-actin抗体ProteinTechHRP-60008
HRP标记的山羊抗兔二抗BeyotimeA0208
ChemiDoc XRS+成像系统Bio-Rad--
Immobilon Western化学发光HRP底物MilliporeWBKLS0100
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
组织样本收集
15对CRC组织和癌旁组织,患者未经放化疗,样本采集时间2023年1月至6月
阅读提示:见Materials and methods - Tissue specimen collection
细胞培养
SW620、HT29、HCT116和FHC细胞系,培养于高糖DMEM+10% FBS+100 U/mL青霉素/链霉素,37°C、5% CO2
阅读提示:见Materials and methods - Cell culture
转染
使用Lipofectamine 2000转染miR-124-3p mimics、inhibitor及ITGB1过表达质粒
阅读提示:见Materials and methods - Transfection
功能实验
CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell侵袭、凋亡实验的具体条件(如细胞数量、时间点)
阅读提示:见Materials and methods - CCK-8 assay、Colony formation assay、Cell migration assay、Cell invasion assay、Cell apoptosis assay
靶基因验证
双荧光素酶报告基因实验:293T细胞共转染ITGB1-WT/MUT和miR-124-3p mimics,检测荧光素酶活性
阅读提示:见Materials and methods - Dual-luciferase reporter assay及Results - ITGB1 was predicted and validated...