检测miR-124-3p在CRC组织和细胞中的表达
明确miR-124-3p在结直肠癌中的表达情况。
收集15对CRC组织和癌旁组织,通过RT-qPCR检测miR-124-3p表达;同时检测CRC细胞系(SW620、HT29、HCT116)和正常结肠黏膜细胞(FHC)中的表达水平。
miR-124-3p inhibits CRC proliferation, migration, and invasion by targeting ITGB1.
包括组织样本分析、细胞功能实验、双荧光素酶报告基因和拯救实验等多个独立证据层级,并包含功能验证和机制验证。
SW620细胞 HT29细胞 HCT116细胞 FHC细胞
miR-124-3p mimics和inhibitor的转染效率(RT-qPCR验证) ITGB1作为miR-124-3p直接靶点的双荧光素酶报告基因实验 miR-124-3p对CRC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 ITGB1过表达对miR-124-3p抑制作用的拯救效果 Wnt/β-catenin通路蛋白(Wnt1和β-catenin)表达的变化
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确miR-124-3p在结直肠癌中的表达情况。
收集15对CRC组织和癌旁组织,通过RT-qPCR检测miR-124-3p表达;同时检测CRC细胞系(SW620、HT29、HCT116)和正常结肠黏膜细胞(FHC)中的表达水平。
验证miR-124-3p对CRC细胞恶性行为的影响。
在SW620和HT29细胞中分别转染miR-124-3p mimics、inhibitor及其阴性对照,通过CCK-8、集落形成、划痕愈合和Transwell侵袭实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。
确定miR-124-3p是否直接调控ITGB1。
通过TargetScan和生物信息学分析预测miR-124-3p与ITGB1的结合位点,并利用双荧光素酶报告基因实验验证其直接结合。同时检测miR-124-3p表达变化对ITGB1 mRNA和蛋白水平的影响。
证明miR-124-3p的功能依赖于靶向ITGB1。
在SW620和HT29细胞中共转染miR-124-3p mimics和ITGB1过表达质粒,检测细胞增殖、集落形成、迁移和凋亡的变化,并通过Western blot检测Wnt1和β-catenin蛋白水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | ITGB1抗体 | ProteinTech | 12594-1-AP |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 |
| 增殖检测 | CCK-8试剂 | Solarbio | CA1210 |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Solarbio | C8470 |
| 侵袭实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 凋亡检测 | annexin V-APC/PI双染试剂盒 | Elabscience | E-CK-A151 |
| 流式细胞仪 | Sysmex Partec | CyFlow | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 1596-026 |
| miRNA提取 | RNAmisi microRNA提取试剂盒 | Aidlab | RN0501 |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Fermentas | K1622 |
| miRNA逆转录 | miRNA第一链合成试剂盒 | Aidlab | PC4801 |
| RT-qPCR | Eastep qPCR master mix试剂盒 | Promega | LS2062 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR036Q | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ITGB1抗体 | ProteinTech | 12594-1-AP | |
| Wnt1抗体 | ProteinTech | 27935-1-AP | |
| β-catenin抗体 | ProteinTech | 80488-1-RR | |
| β-actin抗体 | ProteinTech | HRP-60008 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0100 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本收集 | 15对CRC组织和癌旁组织,患者未经放化疗,样本采集时间2023年1月至6月 阅读提示:见Materials and methods - Tissue specimen collection |
| 细胞培养 | SW620、HT29、HCT116和FHC细胞系,培养于高糖DMEM+10% FBS+100 U/mL青霉素/链霉素,37°C、5% CO2 阅读提示:见Materials and methods - Cell culture |
| 转染 | 使用Lipofectamine 2000转染miR-124-3p mimics、inhibitor及ITGB1过表达质粒 阅读提示:见Materials and methods - Transfection |
| 功能实验 | CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell侵袭、凋亡实验的具体条件(如细胞数量、时间点) 阅读提示:见Materials and methods - CCK-8 assay、Colony formation assay、Cell migration assay、Cell invasion assay、Cell apoptosis assay |
| 靶基因验证 | 双荧光素酶报告基因实验:293T细胞共转染ITGB1-WT/MUT和miR-124-3p mimics,检测荧光素酶活性 阅读提示:见Materials and methods - Dual-luciferase reporter assay及Results - ITGB1 was predicted and validated... |