护阳养坤方通过FTO/m6A-P53通路调节卵巢颗粒细胞凋亡的线粒体途径

背景：早发性卵巢功能不全（POI）对女性生殖健康构成重大挑战。护阳养坤方（HYF）是一种中药复方，已在临床上用于治疗POI超过十年。然而，由于其作用机制不明确，HYF的治疗应用受到很大限制。方法：实验步骤包括给雌性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射VCD，剂量为160 mg/kg/天，持续15天，然后用HYF治疗100天。收集血清样本，使用ELISA检测抗缪勒管激素（AMH）、卵泡刺激素（FSH）和雌二醇（E2）的浓度。通过Dot blot分析和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）评估N6-甲基腺苷（m6A）的水平。蛋白质印迹法用于验证m6A相关催化酶和凋亡相关调节因子（包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1）的差异表达，这些可能参与HYF的作用。构建了特定的shRNA-COV434细胞系用于探索分子机制，最后通过MeRIP-qPCR验证潜在靶点。结果：HYF已被确定对大鼠POI残余卵泡发育有显著影响，尤其是在初始阶段。观察到HYF促进逃逸的窦卵泡进展至完全成熟。此外，HYF表现出增强人卵巢颗粒细胞系COV434增殖的能力，同时抑制这些细胞的凋亡。值得注意的是，HYF治疗导致凋亡蛋白（包括BCL-XL、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和Bcl-2）下调。同时，m6A修饰参与HYF的调控。体内和体外研究均表明，FTO可能在HYF影响的卵巢颗粒细胞中m6A介导的抗凋亡机制中发挥作用。此外，利用qPCR和MeRIP-qPCR技术，P53被确定为FTO介导的m6A修饰的靶基因。结论：这些发现表明，HYF有望成为POI的潜在治疗方法，并提供了对HYF作用机制的更全面理解，特别是其通过调节FTO/m6A-Tp53轴，在POI大鼠卵巢颗粒细胞中阻止P53介导的BCL-2线粒体凋亡途径的能力。