ZFTRAF1表达差异分析
验证ZFTRAF1在正常肺细胞和肺腺癌细胞中的表达差异。
通过qRT-PCR检测BEAS-2B、A549和HCC827细胞中ZFTRAF1的mRNA表达水平。
Zinc finger TRAF-type containing 1 can promote the progression and metastasis of lung adenocarcinoma.
包含细胞系体外模型(A549、HCC827)的基因沉默/过表达功能实验、体外迁移侵袭实验、巨噬细胞共培养极化实验、体内异种移植瘤模型,以及通路抑制剂LY294002回补实验,具备多层次功能与机制验证。
A549细胞 HCC827细胞 THP-1巨噬细胞 Balb/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
ZFTRAF1在A549和HCC827细胞中的表达沉默或过表达效率 sh-ZFTRAF1和OE-ZFTRAF1慢病毒转染的浓度、时间和嘌呤霉素筛选浓度 Transwell迁移和侵袭实验的细胞接种数、基质胶使用和培养时间 A549或HCC827与THP-1巨噬细胞共培养的细胞密度和PMA分化浓度 体内实验中每组小鼠的细胞注射量和观察时间
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ZFTRAF1在正常肺细胞和肺腺癌细胞中的表达差异。
通过qRT-PCR检测BEAS-2B、A549和HCC827细胞中ZFTRAF1的mRNA表达水平。
探究沉默ZFTRAF1对肺腺癌细胞恶性表型的影响。
使用sh-ZFTRAF1慢病毒感染A549和HCC827细胞,通过CCK-8、Transwell和伤口愈合实验检测细胞活力、迁移和侵袭能力,并通过Western blot验证沉默效率。
验证ZFTRAF1是否通过EMT和PI3K-AKT通路发挥作用。
通过Western blot检测EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、MMP9、Snail)和PI3K/AKT磷酸化水平。
探究ZFTRAF1对巨噬细胞极化的影响。
将A549或HCC827细胞与THP-1来源的巨噬细胞共培养,通过流式细胞术检测M1(CD86+, CD64+)和M2(CD163+)标志物,并通过qRT-PCR检测细胞因子表达。
验证ZFTRAF1过表达对细胞功能的影响以及PI3K-AKT通路在其中的关键作用。
使用OE-ZFTRAF1慢病毒感染A549和HCC827细胞,或同时给予PI3K抑制剂LY294002,检测细胞活力、迁移、侵袭、EMT标志物和PI3K/AKT磷酸化水平。
验证ZFTRAF1在体内对肿瘤生长的影响。
将A549或HCC827细胞(对照和KD)皮下注射到Balb/c裸鼠,观察肿瘤生长,并通过H&E、TUNEL、免疫组化和Western blot评估组织学变化和凋亡。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Sigma | D2429 |
| 高糖DMEM培养基 | Pricella Biotechnology | PM150210B | |
| 胎牛血清 | Biosharp | BL201A | |
| 细胞转染 | 聚凝胺 | Solarbio | H8761 |
| 慢病毒(sh-ZFTRAF1、NC、OE-ZFTRAF1、OE-NC) | GenePharma | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Solarbio | CA1210 |
| 酶标仪 | Mettler Toledo | A96 | |
| 台盼蓝试剂 | Solarbio | C0040 | |
| 细胞迁移/侵袭 | 结晶紫溶液 | Biosharp | BL802A |
| 基质胶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Biosharp | BL2214A |
| 巨噬细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | MedChemExpress | HY-18739 |
| 流式细胞术 | 抗CD86-APC抗体 | Proteintech | APC-65068 |
| 抗CD163-FITC抗体 | Proteintech | FITC-65522 | |
| 抗CD64-Atlantic Blue抗体 | Proteintech | AB-65253 | |
| 流式细胞仪 | BD | FACS | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Beyotime Biotechnology | R0016 |
| PrimeScript™逆转录试剂盒 | TAKARA | RR037A | |
| TB Green® Premix Ex Taq™ II FAST qPCR | TAKARA | CN830A | |
| 组织学检测 | 抗E-cadherin抗体 | ABclonal | A3044 |
| 抗N-cadherin抗体 | ABclonal | A0433 | |
| TUNEL染色 | TUNEL检测试剂盒 | Biosharp | BL646 |
| Western Blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Biosharp | BL529B | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 一抗(ZFTRAF1、E-cadherin、N-cadherin、MMP9、Snail、iNOS、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、tubulin、β-actin) | Thermo Fisher Scientific | PA5-66263, | |
| 二抗 | CST | 7074 | |
| 增强化学发光试剂 | Biosharp | BL520b | |
| 化学发光仪 | GE Healthcare | Image | |
| 动物实验 | Balb/c裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件:DMEM培养基、10%FBS,37°C、5%CO2 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Cell culture' |
| 细胞转染 | 慢病毒转染条件:1×10^5细胞接种于24孔板,细胞密度40-50%时加10μg/mL polybrene,转染74h后加4μg/mL嘌呤霉素筛选 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Cell transfection' |
| 细胞活力检测 | CCK-8实验:3000细胞/孔,100μL培养基,加10μL CCK-8后孵育2h,450nm读数 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Cell viability assay' |
| Transwell实验 | 迁移和侵袭实验:2×10^4细胞种于8μm孔径小室,侵袭实验铺60μL Matrigel,24h后固定染色 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Transwell assay' |
| 巨噬细胞共培养 | THP-1细胞密度5×10^5/孔,PMA诱导分化,与A549或HCC827共培养 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Macrophages were co-cultured with lung adenocarcinoma cells' |
| 体内动物实验 | 每组小鼠数量、细胞注射量(2×10^6)、肿瘤测量和处死时间(4周) 阅读提示:详见MATERIAL AND METHODS中的'Animals'和RESULTS中'Effect of silencing ZFTRAF1 expression in vivo' |