CSF1R抑制剂疗效评估
评估CSF1R抑制剂在CRC中的治疗效果
利用CT26和CMT93同系小鼠模型，给予PLX3397、BLZ945和JNJ-40346527治疗，监测肿瘤生长。
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靶向CTGF通过阻止CAF激活克服结直肠癌对CSF1R抑制剂的耐药性
Targeting CTGF overcomes resistance to CSF1R inhibitors by preventing CAF activation in colorectal cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官模型、动物模型、PDX模型及患者样本，并进行了功能验证（基因敲除、中和抗体）和机制验证（通路分析、IMC）。
主要模型
CT26小鼠结直肠癌细胞系 CMT93小鼠结直肠癌细胞系 APKS小鼠结直肠癌类器官 PBMC人源化NCG小鼠PDX模型
重点核对
CSF1R抑制剂PLX3397给药剂量：20 mg/kg，口服，每日一次 CTGF敲除细胞系构建：使用CRISPR/Cas9系统，sgRNA序列为CGCACGTCCATGCTGCACAG和TTTGGAAGGACTCACCGCTG 抗CTGF抗体给药方案：200 μg/只，腹腔注射，每周三次 抗PD-1抗体给药方案：200 μg/只，腹腔注射，每周两次
摘要
Wang等人揭示CSF1R阻断诱导结直肠癌细胞分泌CTGF，激活CAF以阻碍T细胞浸润，并驱动治疗耐药。双重靶向CSF1R和CTGF增强治疗效果，并在CRC模型中与PD-1阻断协同作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CSF1R抑制剂治疗结直肠癌效果有限，其耐药机制是什么，联合何种靶向策略可增强疗效？
- 核心机制
- CSF1R抑制通过激活PI3K/AKT通路促进肿瘤细胞分泌CTGF，进而激活CAFs，导致ECM重塑和T细胞浸润受阻，从而驱动治疗耐药。
- 主要证据
- 体外实验表明PLX3397处理上调CTGF表达并激活PI3K/AKT通路；体内实验中Ctgf敲除或抗CTGF抗体联合CSF1R抑制剂显著抑制肿瘤生长并增加CD8+ T细胞浸润；三药联合（CSF1R抑制剂、抗CTGF、抗PD-1）在多种模型中实现完全肿瘤消退。
- 研究意义
- 本研究提出联合靶向CSF1R和CTGF并配合PD-1阻断的三联疗法，为克服CRC免疫治疗耐药提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤微环境空间分析
分析CSF1R抑制后肿瘤微环境中细胞组成和空间分布的变化
使用成像质谱流式（IMC）技术对肿瘤组织进行多参数成像，并分析细胞亚群、细胞邻域及细胞间相互作用。
转录组分析和ECM重塑验证
鉴定CSF1R抑制后ECM重塑相关的分子变化
对PLX3397处理的肿瘤组织进行RNA-seq，并利用免疫组化、Masson三色染色和天狼星红染色验证ECM沉积和肿瘤硬度。
机制研究：CTGF上调及其信号通路
阐明CSF1R抑制诱导CTGF表达的上游信号通路
通过ELISA、Western blot等方法检测CTGF表达和PI3K/AKT通路激活，并使用PI3K抑制剂和激动剂进行验证。
CTGF功能验证
验证CTGF在CAF激活和ECM重塑中的功能
构建CTGF过表达和敲除细胞系，在体内外评估其对成纤维细胞活化和肿瘤生长的影响。
联合治疗策略评估
评估抗CTGF抗体与CSF1R抑制剂联合及三联疗法（加抗PD-1）的抗肿瘤疗效
在同系小鼠模型、APKS类器官模型和PDX人源化小鼠模型中，给予单药或联合治疗，监测肿瘤生长和免疫浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | PLX-3397 | MCE | HY-16749 |
| JNJ-40346527 | MCE | HY-109086 | |
| BLZ945 | MCE | HY-12768 | |
| 帕木鲁单抗（抗CTGF） | Selleck | A2042 | |
| EDHB | sigma | E24859 | |
| 机制验证 | LY294002 | MCE | HY-10108 |
| 740-Y-P | MCE | HY-P0175 | |
| 免疫治疗 | 抗PD-1单克隆抗体 | selleck | A2122 |
| 类器官培养 | 基质胶 | VivoMatter Biotech | VM002-PRF-10 |
| 类器官完全培养基 | VivoMatter Biotech | RSQ-OCM1102 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Umedium | 3021A |
| 组织染色 | Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | G1472 | |
| ELISA | 小鼠CTGF ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology | ml037697 |
| 人CTGF ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology | ml025961 | |
| 蛋白电泳 | 一步法彩色PAGE凝胶快速制备试剂盒 | EpiZyme | PG212 |
| 多重免疫组化 | 多重荧光免疫组化染色试剂盒 | absin | abs50029 |
| RT-qPCR | PrimeScript FAST RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR092A |
| Talent qPCR预混液 | TIANGEN | FP209 | |
| 成像质谱流式 | 质谱流式成像细胞计数器 | Fluidigm | -- |
| Maxpar X8抗体标记试剂盒 | Fluidigm | -- | |
| 免疫组化 | 抗CTGF兔单克隆抗体 | Proteintech | 25474-1-AP |
| 抗α-SMA兔单克隆抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 抗I型胶原兔单克隆抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| 抗III型胶原兔单克隆抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| Western blot | 抗磷酸化Akt (Ser473)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| 抗Akt兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化PI3K (Tyr467/199)兔单克隆抗体 | Abmart | T40116 | |
| 抗PI3K兔单克隆抗体 | Abmart | T40115 | |
| 抗β-微管蛋白兔单克隆抗体 | ABclonal | A12289 | |
| 抗GAPDH兔单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化 | 抗CD8α兔单克隆抗体 | Abcam | ab217344 |
| 抗细胞角蛋白8兔单克隆抗体 | Abcam | ab53280 | |
| 抗波形蛋白兔单克隆抗体 | Abcam | ab92547 | |
| 抗CD163兔单克隆抗体 | Abcam | ab182422 | |
| 抗E-钙黏蛋白兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Western blot | 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab6702 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab205719 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 |
| Western blot | 抗磷酸化M-CSF受体 (Tyr723)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3155 |
| 对照抗体 | 大鼠IgG2a同型对照（体内） | Selleck | A2123 |
| 流式细胞术 | PerCP/Cyanine5.5标记抗人IFN-γ抗体 | BioLegend | 502526 |
| PerCP/Cyanine5.5标记抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103132 | |
| FITC标记抗小鼠CD3 | BioLegend | 100204 | |
| APC标记抗小鼠CD8a | BioLegend | 155006 | |
| PE/Cyanine7标记抗小鼠IFN-γ | BioLegend | 505826 | |
| PE标记抗人/小鼠颗粒酶B | BioLegend | 372208 | |
| APC/Cyanine7标记抗人CD45 | BioLegend | 368516 | |
| APC标记抗人CD3 | BioLegend | 981012 | |
| FITC标记抗人CD8 | BioLegend | 980908 | |
| 细胞培养 | CT26 | Pricella Biotechnology | CL-0071 |
| CMT93 | Pricella Biotechnology | CL-0920 | |
| NIH/3T3 | Pricella Biotechnology | CL-0171 | |
| Caco2 | Pricella Biotechnology | CL-0050 | |
| LS174T | Pricella Biotechnology | CL-0145 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CSF1R抑制剂治疗 | PLX3397给药剂量（20 mg/kg，口服，每日一次）；BLZ945给药剂量（200 mg/kg，口服，每日一次）；JNJ-40346527给药剂量（20 mg/kg，口服，每周五天）；对照组给予PBS 200 μL口服或腹腔注射 阅读提示：STAR Methods, Animal models |
| CTGF敲除细胞构建 | CRISPR/Cas9系统，Ctgf sgRNA序列（sgRNA1: CGCACGTCCATGCTGCACAG；sgRNA2: TTTGGAAGGACTCACCGCTG），克隆至lenti-CRISPR v2载体（Addgene #52961） 阅读提示：STAR Methods, Construction of Ctgf-KO cells |
| 抗CTGF抗体治疗 | 抗CTGF抗体（Pamrevlumab）给药方案：200 μg/只，腹腔注射，每周三次；开始时间：肿瘤植入后一周 阅读提示：STAR Methods, Animal models |
| 抗PD-1联合治疗 | 抗PD-1抗体给药方案：200 μg/只，腹腔注射，每周两次；开始时间：肿瘤植入后一周 阅读提示：STAR Methods, Animal models |
| APKS类器官模型 | APKS类器官构建：Apcfl/fl KrasLSL-G12D小鼠结肠肿瘤组织分离，Smith4敲除；皮下移植数量（未明确说明） 阅读提示：STAR Methods, Murine colon organoid culture and genome engineering |