Leucine Attenuates Osteoarthritis via mTORC1/LXRα-Mediated Macrophage Reprogramming and Rspo2/β-Catenin Axis Suppression.
包含CIOA小鼠模型、BMDM细胞实验、ATDC5细胞实验、多组学分析及GSK2033功能验证等多个独立证据层级。
CIOA小鼠模型（C57BL/6小鼠） 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） ATDC5软骨祖细胞
亮氨酸给药剂量（50 mg/kg和100 mg/kg）和给药方式（腹腔注射） GSK2033剂量（30 mg/kg，每周三次）和LXRα抑制浓度（2 μmol/L） LPS和IFN-γ诱导M1极化浓度（100 ng/mL和20 ng/mL），IL-4诱导M2极化浓度（20 ng/mL） ATDC5细胞处理使用巨噬细胞条件培养基（10%）和重组RSPO2蛋白（200 ng/mL） CIOA模型建立：胶原酶剂量（1 U）和注射途径（关节内注射，连续两天）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立胶原酶诱导的创伤性骨关节炎模型，并验证亮氨酸对软骨退化和骨赘形成的保护作用。
8周龄雄性C57BL/6小鼠右膝关节腔注射1U胶原酶（连续两天）建立CIOA模型，7天后随机分为假手术组、模型组、低剂量Leu组（50mg/kg）和高剂量Leu组（100mg/kg），腹腔注射4周。通过Safranin O/Fast Green染色、OARSI评分、micro-CT、H&E染色评估软骨退化、骨赘形成和滑膜炎症。
验证亮氨酸是否通过mTORC1/LXRα通路调节巨噬细胞M1/M2极化。
分离并分化BMDMs，用LPS+IFN-γ诱导M1极化，用IL-4诱导M2极化，并给予Leu（200 μg/mL）和/或GSK2033（2 μmol/L）处理。通过RT-qPCR检测M1标记基因（iNOS, TNF-α, CD86）和M2标记基因（Arg1, CD206, IL-10），ELISA检测细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10, TGF-β），Western blot检测p-STAT6、STAT6、p-mTOR、mTOR和LXRα蛋白表达，免疫荧光检测iNOS和CD206阳性细胞比例。
通过转录组学、WGCNA和机器学习识别亮氨酸调节巨噬细胞极化的核心基因和通路。
对M1极化和Leu处理的BMDMs进行RNA-seq，筛选差异表达基因（DEGs），进行GO和KEGG富集分析。通过WGCNA识别与Leu处理相关的模块，将模块hub基因与DEGs取交集，再利用LASSO回归筛选关键基因。
证实亮氨酸通过mTORC1/LXRα通路调节巨噬细胞极化，并验证mTORC1与LXRα的相互作用。
使用雷帕霉素（mTORC1抑制剂）和GSK2033（LXRα抑制剂）处理BMDMs，检测M1标记基因表达。通过免疫共沉淀（Co-IP）检测mTOR和LXRα的相互作用。通过核质分离和免疫荧光检测LXRα核转位。
探究亮氨酸处理的巨噬细胞对软骨祖细胞功能的影响，以及Rspo2/β-catenin轴的作用。
收集不同处理组的巨噬细胞条件培养基（CM），应用于ATDC5软骨祖细胞48小时。通过RT-qPCR检测软骨标记（Col2a1, Acan）和肥大标记（Runx2, Col10a1），Western blot检测β-catenin通路蛋白（β-catenin, Cyclin D1, MMP13），甲苯胺蓝染色评估基质分泌。另外，用重组RSPO2蛋白（200 ng/mL）处理ATDC5细胞验证Rspo2的作用。
在CIOA小鼠模型中验证LXRα抑制剂GSK2033能否逆转亮氨酸的软骨保护和抗骨赘形成作用。
CIOA小鼠分为Leu组（100 mg/kg）和Leu+GSK2033组（30 mg/kg，每周三次），处理4周。通过Safranin O/Fast Green染色、OARSI评分、micro-CT、H&E染色评估软骨退化、骨赘和滑膜炎症。通过免疫荧光和免疫组化检测iNOS（M1）和CD206（M2）表达，Western blot检测相关蛋白，ELISA和IHC检测Rspo2水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CIOA模型建立 | 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Leu治疗 | 亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8912 |
| GSK2033干预 | GSK2033 | MedChemExpress | HY-108688 |
| 巨噬细胞分化 | αMEM培养基 | Gibco | 12571063 |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | 文中未明确说明 | -- | |
| ATDC5细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 11330-032 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 巨噬细胞极化刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| 干扰素-γ | PeproTech | 315-05 | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | 214-14 | |
| 条件培养基制备 | 0.22 μm滤膜 | Millipore | SLGP033RS |
| mTORC1抑制 | 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNA-seq文库构建 | Illumina TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2001 |
| RNA-seq测序 | Illumina NextSeq 500测序平台 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Co-IP | 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| 核质分离 | NE-PER™核和细胞质提取试剂 | Thermo | 78833 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| Western blot转膜 | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| Western blot一抗 | p-STAT6抗体 | Cell Signaling Technology | 56554 |
| STAT6抗体 | Cell Signaling Technology | 5397 | |
| p-mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 5536 | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| LXRα抗体 | Abcam | ab176323 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| Cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| MMP13抗体 | Abcam | ab39012 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| Western blot二抗 | HRP偶联抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 |
| Western blot检测 | ECL化学发光试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
| Western blot成像 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 免疫荧光 | F4/80抗体 | Abcam | ab6640 |
| iNOS抗体 | Abcam | ab178945 | |
| CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 免疫荧光二抗 | Alexa Fluor 488偶联二抗 | Abcam | ab150077 |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Abcam | ab150080 | |
| 免疫荧光核染色 | DAPI | Solarbio | C0060 |
| 免疫荧光成像 | 共聚焦显微镜（TCS SP8） | Leica Microsystems | -- |
| IHC抗原修复 | 柠檬酸盐缓冲液 | 文中未明确说明 | -- |
| IHC封闭 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647 |
| IHC二抗 | HRP偶联二抗 | Sigma-Aldrich | A6154 |
| IHC显色 | DAB显色试剂盒 | Abcam | ab64238 |
| IHC成像 | 光学显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 甲苯胺蓝染色 | 甲苯胺蓝 | 文中未明确说明 | -- |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | MTA00B |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M6000B | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | MLB00C | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M1000B | |
| TGF-β ELISA试剂盒 | R&D Systems | MB100B | |
| RSPO2 ELISA试剂盒 | Abbexa | abx258663 | |
| ELISA读板 | 酶标仪（iMark） | Bio-Rad | -- |
| 组织固定 | 中性缓冲福尔马林 | Solarbio | G2161 |
| 组织切片 | 切片机（Leica RM2235） | Leica | -- |
| 组织学染色 | 番红O | Sigma-Aldrich | S2255 |
| 固绿 | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 苏木素 | Solarbio | H8070 | |
| 伊红 | Solarbio | E6070 | |
| 组织学成像 | 光学显微镜（BX53） | Olympus | -- |
| micro-CT扫描 | micro-CT扫描仪（Bruker 1272） | Bruker | -- |
| micro-CT重建 | NRecon软件（v1.7.5.9） | Bruker | -- |
| micro-CT分析 | CTAn软件 | Bruker | -- |
| micro-CT染色 | 磷钨酸 | 文中未明确说明 | -- |
| 重组蛋白刺激 | 重组人RSPO2蛋白 | R&D Systems | 3266-RS-025 |
| IHC RSPO2抗体 | RSPO2抗体 | R&D Systems | AF3474 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CIOA模型建立 | 动物品系、性别、年龄；胶原酶剂量和注射体积；注射时间间隔；模型建立时间 阅读提示：Materials and Methods "Establishment of the Collagenase-Induced Traumatic Osteoarthritis Model" |
| Leu治疗 | Leu剂量（低/高）、给药途径、频率、持续时间 阅读提示：Materials and Methods "Leu treatment efficacy experiment" |
| GSK2033干预 | GSK2033剂量、给药频率、持续时间；对照组设置 阅读提示：Materials and Methods "GSK2033 intervention to reverse Leu treatment effects" |
| 巨噬细胞极化 | BMDM分化条件（M-CSF浓度、时间）；M1/M2极化诱导剂浓度和时间；Leu和GSK2033处理浓度和时间 阅读提示：Materials and Methods "Macrophage Polarization and Drug Treatment" 和 "Isolation of Mouse Macrophages" |
| ATDC5细胞实验 | 细胞培养条件；CM浓度；处理时间；rhRSPO2浓度 阅读提示：Materials and Methods "Culture and Treatment of ATDC5 Chondroprogenitor Cells" |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法；测序平台；比对参考基因组；DEGs阈值；WGCNA参数；LASSO参数 阅读提示：Materials and Methods "RNA Extraction and Sequencing", "Screening of Differentially Expressed Genes", "WGCNA", "Identification of Key Genes Using Machine Learning" |
