单细胞和空间转录组分析
解析AAGN肾组织及外周血中细胞组成和基因表达变化，鉴定关键细胞类型和信号通路。
对3例AAGN和3例对照肾组织进行空间转录组测序，对15例AAGN患者和3例健康儿童外周血进行单细胞RNA测序，鉴定细胞亚群和差异表达基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CXCL12/CXCR4通过ELMO1/DOCK180/RAC1信号通路调控巨噬细胞胞葬作用，在ANCA相关性肾小球肾炎中诱导肾小球新月体形成和纤维化
CXCL12/CXCR4 modulates macrophage efferocytosis to induce glomerular crescent formation and fibrosis via ELMO1/DOCK180/RAC1 signaling in ANCA-associated glomerulonephritis.
实验完整度
高包含单细胞测序、空间转录组、体外细胞实验（趋化、凋亡、胞葬）、siRNA敲低、Co-IP、动物模型及药物治疗等多层次验证。
主要模型
EA.hy926内皮细胞系 THP-1单核细胞系及诱导的巨噬细胞 WKY大鼠EAV模型 AAGN患者外周血及肾活检组织
重点核对
AAGN患者血清刺激时间（3天） LIT927浓度(30 μM)和AMD3100浓度(100 μM) EAV模型中hMPO剂量(1600 μg/kg)和PTX剂量(1 μg) siRNA敲低效率（>50% mRNA降低）
摘要
背景：ANCA相关性肾小球肾炎（AAGN）是儿童尿毒症的主要原因，由介导新月体形成和纤维化的巨噬细胞驱动。尽管巨噬细胞发挥关键作用，但调控AAGN中单核细胞募集和巨噬细胞极化的信号仍不清楚。方法：我们利用单细胞测序解析AAGN的细胞动力学，并进行体外和体内实验探讨CXCL12/CXCR4信号轴在单核细胞募集和巨噬细胞胞葬作用中的作用。蛋白质相互作用分析进一步描绘了所涉及的下游信号通路。结果：凋亡的肾小球内皮细胞释放的CXCL12将CXCR4+单核细胞募集至肾组织，在那里它们分化为M2极化的巨噬细胞，并促进AAGN的进展。CXCR4信号通过ELMO1/DOCK180/RAC1胞葬途径介导M2极化，导致TGF-β1的分泌，促进新月体向纤维化进展。血浆CXCL12和CXCR4水平以及CXCR4+巨噬细胞浸润，将AAGN与其他新月体性肾炎类型区分开来。LIT927和AMD3100治疗显著改善了EAV模型中的肾功能障碍和新月体形成。结论：本研究揭示了CXCL12/CXCR4信号轴在AAGN病理过程中发挥关键调控作用。通过建立内皮细胞与单核细胞/巨噬细胞之间的特异性分子对话机制，凋亡内皮细胞释放的CXCL12可激活单核细胞/巨噬细胞表面的CXCR4，从而促进单核细胞迁移，增强巨噬细胞介导的胞葬作用，并转化为促纤维化表型。靶向干预CXCL12/CXCR4为AAGN的治疗提供了一种有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AAGN中巨噬细胞介导的新月体形成和纤维化的分子机制尚不清楚，特别是调控单核细胞募集和巨噬细胞M2极化的信号途径。
- 核心机制
- 凋亡肾小球内皮细胞释放CXCL12，作为“find me”信号招募外周血CXCR4+单核细胞；CXCR4通过与ELMO1相互作用，激活ELMO1/DOCK180/RAC1胞葬信号轴，促进巨噬细胞M2极化，并分泌TGF-β1，进而驱动新月体形成和纤维化。
- 主要证据
- 单细胞测序和空间转录组发现CXCL12和CXCR4表达升高；体外实验证实内皮细胞凋亡后释放CXCL12，招募单核细胞；CXCR4与ELMO1相互作用，敲低CXCR4降低ELMO1、DOCK180、MERTK、CD163和TGF-β1水平，抑制胞葬及M2极化；EAV模型中LIT927和AMD3100减轻肾功能损伤和新月体形成。
- 研究意义
- 本研究揭示CXCL12/CXCR4轴在AAGN病理中的关键调控作用，靶向该轴可能为AAGN治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养及AAGN血清刺激
验证AAGN血清对内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞的影响，模拟体内环境。
将EA.hy926、THP-1等细胞用AAGN患者血清（来自5名MPO+AAGN患者混合）或健康血清刺激3天，分析内皮细胞凋亡、CXCL12表达、单核细胞趋化及巨噬细胞极化。
验证内皮细胞凋亡与CXCL12释放
确认AAGN条件下肾小球内皮细胞凋亡及CXCL12的释放。
通过免疫荧光、Western blot、流式细胞术和CCK-8检测内皮细胞凋亡标志物（BAX、BCL-2、cleaved-Caspase-3）和CXCL12表达。
单核细胞迁移和浸润实验
验证内皮细胞释放的CXCL12能否招募单核细胞。
使用Transwell实验，将THP-1细胞置于上室，下室为AAGN血清刺激的EA.hy926细胞，检测单核细胞迁移；并通过免疫荧光观察肾组织中CD14+单核细胞浸润。
验证CXCR4在单核/巨噬细胞中的表达
明确CXCR4在AAGN相关单核细胞和巨噬细胞中的表达及特异性。
通过单细胞测序、流式、Western blot和免疫荧光检测CXCR4表达，并比较不同肾炎类型中CXCR4+CD163+或CXCR4+CD68+细胞的浸润。
细胞功能实验：胞葬作用检测
验证AAGN血清刺激的巨噬细胞胞葬功能增强及M2极化。
将THP-1诱导的巨噬细胞与凋亡的Jurkat细胞（经UV诱导）共培养，检测吞噬效率；并通过Western blot检测MERTK、CD163、TGF-β1等表达。
机制研究：siRNA敲低和Co-IP
确认CXCR4对ELMO1/DOCK180/RAC1通路的调控机制。
通过siRNA敲低CXCR4或ELMO1，检测下游蛋白表达变化；通过Co-IP验证CXCR4与ELMO1的相互作用；使用CHX追踪ELMO1蛋白半衰期。
体内动物实验
评估CXCL12/CXCR4抑制剂对EAV模型肾损伤和新月体形成的影响。
使用WKY大鼠构建EAV模型，给予LIT927或AMD3100药物治疗，检测肾功能指标、蛋白尿、血尿及肾组织病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | GEXSCOPE单细胞RNA建库试剂盒 | Singleron Biotechnologies | -- |
| 空间转录组测序 | 10X Genomics Visium空间基因表达解决方案 | 10X Genomics | -- |
| 免疫荧光 | 抗CD163抗体 | Abcam | ab156769 |
| 抗CD86抗体 | ABclonal | A1199 | |
| 抗CD14抗体 | Proteintech | 17000-1-AP | |
| 抗CD31抗体 | ABclonal | A19014 | |
| 抗ERG抗体 | Santa Cruz | sc-376293 | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL原位凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A325 |
| 免疫荧光 | 抗CXCR4抗体 | Abcam | ab124824 |
| 抗CD68抗体 | Santa Cruz | sc-20060 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| 尼康激光共聚焦显微镜 | Nikon | A1R | |
| 免疫组化 | 抗TGF-β1抗体 | Abcam | ab215715 |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5964 | |
| 抗CXCL12抗体 | Abcam | ab9797 | |
| 染色 | PAS染色试剂盒 | Solarbio | G1281 |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-9001 |
| 病理成像 | 数字病理扫描仪 | Shengqiang Technology CO, Ltd | SQS-600P |
| ELISA | CXCL12 ELISA试剂盒（人） | Cusabio | CSB-EQ027490HU |
| CXCL12 ELISA试剂盒（大鼠） | Cusabio | CSB-E08729r | |
| 可溶性CXCR4 ELISA试剂盒（人） | Cusabio | CSB-E12825h | |
| 可溶性CXCR4 ELISA试剂盒（大鼠） | Cusabio | CSB-E12703r | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| PMA | Sigma-Aldrich | -- | |
| LIT927 | Selleck | -- | |
| AMD3100 | Selleck | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | FACSCanto plus流式细胞仪 | BD | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 胞葬实验 | Vybrant DiD溶液 | Invitrogen | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Scientific | -- |
| RNA提取 | SteadyPure快速RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| 反转录 | HiScript III第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| qPCR | SYBR Green | Accurate Biology | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA | NCM Biotech | -- |
| Western blot | SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Scientific | -- |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗CXCL12抗体 | Invitrogen | PA5-114344 | |
| 抗BCL-2抗体 | ABclonal | A19693 | |
| 抗BAX抗体 | Santa Cruz | sc-7480 | |
| 抗cleaved Caspase-3抗体 | ABclonal | A11021 | |
| 抗CD31抗体 | Santa Cruz | sc-376764 | |
| 抗ERG抗体 | Santa Cruz | sc-376293 | |
| 抗CD163抗体 | Abcam | ab182422 | |
| 抗CD68抗体 | Santa Cruz | sc-20060 | |
| 抗CD86抗体 | ABclonal | A1199 | |
| 抗CXCR4抗体 | NOVUS | NBP1-77067 | |
| 抗CXCR4抗体 | Invitrogen | PA5-19856 | |
| 抗MERTK抗体 | Santa Cruz | sc-365499 | |
| 抗ELMO1抗体 | Santa Cruz | sc-271519 | |
| 抗DOCK1抗体 | ABclonal | A17359 | |
| 抗RAC1抗体 | Proteintech | 66122-1-Ig | |
| 抗TGF-β1抗体 | Abcam | ab215715 | |
| 免疫共沉淀 | IP裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| Protein A/G磁珠 | Selleck | -- | |
| 动物实验 | 人MPO | Elastin Products Company | -- |
| 弗氏完全佐剂 | -- | -- | |
| 百日咳毒素 | List Biological Labs | -- | |
| 人血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 羧甲基纤维素钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尿液分析 | 尿液分析试纸 | Mission | -- |
| 全自动尿液生化分析系统 | Roche | Cobas | |
| 肾功能分析 | 全自动血液生化系统 | Roche | Cobas |
| 组织学染色 | 普鲁士蓝染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞和空间转录组测序 | 样本类型（外周血/肾组织）、样本量（AAGN肾组织3例，对照3例；外周血AAGN 15例，对照3例）、建库试剂盒及测序平台 阅读提示：参见Methods“RNA and spatial transcriptome sequencing” |
| 细胞培养及刺激 | 细胞系（EA.hy926, THP-1等）、血清浓度（10%）、刺激时间（3天）、PMA浓度（150 ng/mL）及处理时间（48小时） 阅读提示：参见Methods“Cell culture and stimulation” |
| 凋亡检测 | 细胞系（EA.hy926）、血清刺激时间（3天）、Annexin V-FITC/PI染色步骤 阅读提示：参见Methods“Cell apoptosis assay by flow cytometry” |
| 胞葬作用实验 | THP-1诱导巨噬细胞、凋亡Jurkat细胞制备（UV 254 nm，15分钟）、共培养比例（1:5）和时间（2小时） 阅读提示：参见Methods“Mφ efferocytosis” |
| siRNA敲低 | siRNA序列（靶向CXCR4和ELMO1）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、敲低时间（48小时） 阅读提示：参见Methods“siRNA knockdown”及Table 7 |
| 体内动物实验 | 大鼠品系（WKY）、年龄（4周）、雌性、诱导剂量（hMPO 1600 μg/kg，PTX 1 μg）、给药剂量（LIT927 100 mg/kg，AMD3100 5 mg/kg）及时间 阅读提示：参见Methods“Animal model and medical treatments” |