单细胞测序分析肺腺癌微环境
鉴定肺腺癌组织和癌旁组织中免疫细胞亚群差异，并分析Tregs亚群及其与TGF-β通路的关系。
对3例肺腺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行scRNA-seq，鉴定主要细胞类型和Treg亚群，并进行拟时序分析和通路富集分析。
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冷冻消融诱导肺腺癌中Treg细胞和TGF-β通路的调节：对增强抗肿瘤免疫的意义
Cryoablation-induced modulation of Treg cells and the TGF-β pathway in lung adenocarcinoma: implications for increased antitumor immunity.
实验完整度
高包含临床样本前瞻性观察、scRNA-seq、bulk RNA-seq、细胞冷冻消融共培养模型及小鼠皮下移植瘤模型，并进行了功能验证（Treg、IFN-γ）和机制验证（TGF-β/SMAD/FOXP3通路）。
主要模型
肺腺癌患者外周血样本 肺腺癌组织及癌旁组织 A549、H1299和LLC肺腺癌细胞系 C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
临床患者：冷冻消融方案（双冻融循环：冰球形成20分钟、融化10分钟、再冷冻15分钟，探针温度-196°C）及Treg和TGF-β1检测时间点（术前1天、术后3天、术后1个月） 体外冷冻消融模型：细胞冻融条件（-80°C 7分钟或液氮5分钟）及坏死培养基比例（2:1） 体内冷冻消融：小鼠肿瘤冷冻消融参数（-120°C，10秒，两次循环）及SB431542给药剂量和途径（1μM，腹腔注射，每日一次，术后0-14天） 细胞共培养条件：PBMC激活（anti-CD3 5μg/mL包被，anti-CD28 5μg/mL，IL-2 0.4μL/mL）及共培养时间（72小时）
摘要
背景：冷冻消融在肺腺癌的综合治疗中发挥关键作用，其特点是能够激活抗肿瘤免疫。本研究旨在探讨冷冻消融对局部免疫微环境的影响，重点关注调节性T细胞（Tregs）和TGF-β通路。方法：采用单细胞测序鉴定肺腺癌组织和相邻非癌组织之间免疫细胞群和相关通路表达的差异。在北京中医药大学东方医院对肺腺癌冷冻消融前后外周血中Tregs的变化进行前瞻性观察。对小鼠肿瘤组织进行批量RNA-seq分析，以预测冷冻消融诱导抗肿瘤免疫的潜在机制。最后，通过细胞冷冻消融和小鼠皮下移植瘤模型进行体外和体内实验验证这些预测。结果：单细胞RNA测序分析揭示了肺腺癌中Tregs亚群与免疫应答调节之间的复杂相互作用，强调了TGF-β通路的参与。与术前和术后3天水平相比，冷冻消融后30天Tregs水平显著降低。细胞和小鼠冷冻消融模型验证了冷冻消融对Tregs的抑制作用及其刺激抗肿瘤免疫的潜力。此外，批量RNA-seq结果表明冷冻消融通过TGF-β通路调节术后免疫。冷冻消融降低TGF-β1的表达水平，抑制Smad2和Smad3的磷酸化，并下调FOXP3的表达，从而抑制CD4+T细胞前体向Tregs的转化。此外，冷冻消融增强了干扰素-γ（IFN-γ）的表达，从而促进其抗肿瘤活性。结论：本研究揭示了冷冻消融通过抑制Tregs和通过TGF-β通路激活抗肿瘤免疫，有效改造肺腺癌微环境。这些发现对优化基于冷冻消融的疗法和指导未来肺腺癌治疗的临床试验具有重要意义。试验注册：本试验在中国临床试验注册中心注册（Chictr.org.cn，ChiCTR2000038580，2020年9月24日）。补充信息：在线版本包含补充材料，可访问10.1186/s12916-025-03926-1。关键词：冷冻消融，Tregs，TGF-β通路，单细胞测序，免疫应答
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 冷冻消融如何通过调节Tregs和TGF-β通路影响肺腺癌的抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- 冷冻消融通过下调TGF-β1表达，抑制Smad2和Smad3的磷酸化，从而下调FOXP3表达，抑制CD4+T细胞前体向Tregs的转化，并增强IFN-γ表达，促进抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 基于临床患者外周血Tregs和TGF-β1水平变化、scRNA-seq和bulk RNA-seq分析，以及细胞和小鼠冷冻消融模型中的qPCR、Western blot、流式细胞术和ELISA验证。
- 研究意义
- 作者提出这些发现对优化基于冷冻消融的疗法和指导未来肺腺癌治疗的临床试验具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床观察冷冻消融前后Tregs和TGF-β1变化
评估肺腺癌患者冷冻消融后外周血中Tregs和TGF-β1水平的动态变化。
收集接受冷冻消融的IIIb/IV期肺腺癌患者外周血，在术前、术后3天和术后30天通过流式细胞术检测Tregs，ELISA检测TGF-β1。
体外细胞冷冻消融模型验证
在体外验证冷冻消融对Treg分化的影响，并区分坏死和亚致死细胞的作用。
构建A549和H1299细胞冷冻消融模型，分为四组（A:健康细胞+完全培养基，B:健康细胞+坏死培养基，C:亚致死细胞+完全培养基，D:亚致死细胞+坏死培养基），与抗CD3/CD28和IL-2激活的PBMC共培养，72小时后流式检测Treg比例。
体内小鼠移植瘤模型验证
在动物水平验证冷冻消融对肿瘤生长、转移及Tregs和TGF-β通路的影响。
C57BL/6小鼠皮下注射LLC细胞构建移植瘤模型，随机分为Con、SB431542、Cry和Cry+SB431542四组，进行冷冻消融或药物处理，观察肿瘤体积、组织学变化、Tregs比例及通路蛋白表达。
转录组测序分析机制
通过bulk RNA-seq鉴定冷冻消融后差异表达基因及富集通路，预测潜在机制。
提取冷冻消融组和对照组小鼠肿瘤组织的RNA进行测序，鉴定DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
机制验证实验
验证冷冻消融通过TGF-β/SMAD/FOXP3通路抑制Treg分化，并增强IFN-γ表达。
通过qPCR和Western blot检测小鼠肿瘤组织中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Foxp3的表达；ELISA检测人和小鼠血清及细胞上清中TGF-β1、IFN-γ、IL-2水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | sCelLive™ | -- | -- |
| 单细胞RNA文库构建 | GEXSCOPE®单细胞RNA文库试剂盒 | -- | -- |
| 冷冻消融 | 冷冻消融系统 | -- | -- |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| RPMI-1640培养基 | HyClone | -- | |
| T细胞激活 | 抗CD3抗体 | BioLegend | clone: UCHT1 |
| 抗CD28抗体 | BioLegend | Clone: CD28.2 | |
| 白细胞介素-2 | Novoprotein | GMP-CD66 | |
| 动物实验 | SB431542 | APExBIO | -- |
| 组织学 | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| ELISA | TGF-β1 ELISA试剂盒 | Proteintech | -- |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Proteintech | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取液 | Servicebio | -- | |
| RT-qPCR | Reveraid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| SYBR qPCR SuperMix Plus | Novoprotein | -- | |
| Western blot | 抗TGF-β1抗体 | Proteintech | 21898-1-AP |
| 抗SMAD2抗体 | Proteintech | 12570-1-AP | |
| 抗p-SMAD2抗体 | Abcam | ab188334 | |
| 抗SMAD3抗体 | Proteintech | 66516-1-Ig | |
| 抗p-SMAD3抗体 | Abcam | ab52903 | |
| 抗FOXP3抗体 | Abcam | ab215206 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 流式细胞术 | Foxp3染色缓冲液套装 | eBioscience | -- |
| 共培养 | Transwell小室（0.4 μm） | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者分期、冷冻消融具体参数、Treg和TGF-β1检测时间点 阅读提示：Methods：Sample collection and processing |
| scRNA-seq分析 | 组织处理时间、文库构建试剂盒、测序平台、质控标准 阅读提示：Methods：Tissue preparation and scRNA-seq library construction，Cell cluster analysis |
| 体外冷冻消融模型 | 细胞冻融条件、坏死培养基比例、共培养细胞数和时间 阅读提示：Methods：Construction of the cryoablation cell model，Co-culture assay |
| 小鼠模型和冷冻消融 | 小鼠品系、性别、周龄、细胞接种量、冷冻消融参数、SB431542给药方案 阅读提示：Methods：Mouse models and cryoablation |
| 机制验证 | 抗体货号、内参、qPCR定量方法 阅读提示：Methods：Western blot (WB) analysis，Real-time quantitative polymerase chain reaction |