HSCB在HSCs红细胞生成中的功能鉴定
检验HSCB是否参与人CD34+CD90+HSCs的红细胞生成，并区分其作用是否依赖铁硫簇生物合成。
用shRNA敲低HSCB、ISCU和NFS1，诱导红系分化17天，检测红系分化标志物、乌头酸酶和PDH活性及血红素含量。
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PI3K/HSCB轴促进FOG1核转位以推动红细胞生成和巨核细胞生成
PI3K/HSCB axis facilitates FOG1 nuclear translocation to promote erythropoiesis and megakaryopoiesis.
实验完整度
高包含细胞系和原代细胞两种证据层级，并涵盖基因敲低/敲除、挽救实验、蛋白互作和机制验证。
主要模型
K562人红白血病细胞 脐带血来源人CD34+CD90+造血干细胞
重点核对
HSCB敲低或敲除效率及维持时间（shRNA或CRISPR/Cas9） EPO诱导K562细胞红系分化条件（5 U/ml EPO，48小时） CD34+CD90+HSCs红系或巨核系分化诱导培养基及时间（如Ery 17天或MK 14天） PI3K抑制剂wortmannin处理浓度（K562 200 nM，HSCs 100 nM） TACC3抑制剂KHS101处理浓度（K562 5 μM，HSCs 4 μM）
摘要
红细胞生成和巨核细胞生成受信号通路严格调控。然而，信号通路调控控制红细胞生成和巨核细胞生成的关键转录因子的精确分子机制仍未完全阐明。在此，我们鉴定出热休克同源蛋白B（HSCB），其以铁硫簇传递功能而闻名，是K562人红白血病细胞和脐带血来源的人CD34+CD90+造血干细胞（HSCs）红细胞生成过程中，以及CD34+CD90+HSCs巨核细胞生成过程中，GATA1之友（FOG1）核转位所必需的蛋白。机制上，HSCB可被磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）磷酸化，从而结合并介导转化酸性卷曲螺旋蛋白3（TACC3）的蛋白酶体降解，TACC3原本将FOG1滞留于细胞质中，从而促进FOG1核转位。鉴于PI3K在红细胞生成和巨核细胞生成过程中均被激活，且FOG1是这些过程的关键转录因子，我们的发现阐明了HSCB在红细胞生成和巨核细胞生成中的一个重要的、先前未被识别的、独立于铁硫簇传递的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 信号通路如何调控红系和巨核系关键转录因子FOG1的核转位，从而影响红细胞生成和巨核细胞生成？
- 核心机制
- PI3K磷酸化HSCB，促进HSCB与TACC3结合并介导其蛋白酶体降解，解除TACC3对FOG1的胞质滞留，从而促进FOG1核转位。
- 主要证据
- 在K562细胞和CD34+CD90+HSCs中，HSCB敲低或敲除导致FOG1核转位减少，FOG1过表达或KHS101抑制TACC3可恢复红系分化；wortmannin抑制PI3K阻断HSCB功能。
- 研究意义
- 揭示HSCB独立于铁硫簇传递的新功能，为理解EPO/EPOR和TPO/MPL信号调控红系和巨核系分化提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HSCB在K562细胞红细胞生成中的功能验证
在K562细胞中验证HSCB敲除对EPO诱导红系分化的影响，并筛选受HSCB调控的核蛋白。
建立HSCB敲除K562细胞，用EPO诱导分化，检测红系标志物，并通过TMT-MS分析核蛋白组。
HSCB调控FOG1核转位的机制研究
阐明HSCB缺失如何导致FOG1核转位受阻，并验证其因果作用。
通过FOG1过表达、细胞分级分离和免疫荧光检测FOG1定位，并通过亲和纯化-MS鉴定FOG1差异结合蛋白。
HSCB促进TACC3降解并释放FOG1的验证
验证HSCB是否通过结合并介导TACC3蛋白酶体降解来促进FOG1核转位。
检测EPO处理后HSCB与TACC3、TACC3与FOG1的相互作用，并用MG132抑制蛋白酶体观察TACC3水平变化。
PI3K磷酸化HSCB的必要性验证
确定EPO/EPOR信号下游哪条通路对HSCB功能化至关重要，并检验PI3K磷酸化HSCB是否影响其铁硫簇传递功能。
使用JAK2、PI3K、RAS抑制剂处理EPO诱导的K562细胞，检测TACC3水平和FOG1核转位，并检测HSCB磷酸化水平。
PI3K-HSCB轴在巨核细胞生成中的功能验证
验证PI3K-HSCB轴是否也参与CD34+CD90+HSCs的巨核细胞生成。
敲低HSCB或使用wortmannin处理HSCs，诱导巨核分化14天，检测巨核标志物、FOG1核转位和TACC3水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Procell | PM150510 |
| 胎牛血清 | Wisent Bioproducts | 085-150 | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | PB180120 | |
| StemSpan无血清扩增培养基II | STEMCELL Technologies | 09655 | |
| StemSpan CD34+扩增补充剂 | STEMCELL Technologies | 02691 | |
| 红细胞分化诱导 | StemSpan红系扩增补充剂 | STEMCELL Technologies | 02692 |
| 巨核细胞分化诱导 | StemSpan巨核细胞扩增补充剂 | STEMCELL Technologies | 02696 |
| 药物处理 | 人重组促红细胞生成素 | GlpBio | GP20193 |
| 鲁索替尼 | GlpBio | GC14191 | |
| 渥曼青霉素 | GlpBio | GC12338 | |
| 洛那法尼 | GlpBio | GC10330 | |
| MG132 | GlpBio | GC10383 | |
| KHS101 | GlpBio | GC13582 | |
| 转染 | RFectSP质粒DNA转染试剂 | Biodai | 21027 |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | GlpBio | GC16384 |
| 酶活性检测 | 乌头酸酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab109712 |
| PDH酶活性微量板检测试剂盒 | Abcam | ab109902 | |
| 蛋白浓度测定 | Omni-Easy即时BCA蛋白检测试剂盒 | Epizyme | ZJ102 |
| 裂解 | RIPA裂解液 | Epizyme | PC101 |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞分选 | CD34磁珠试剂盒UltraPure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 |
| 人CD90磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-096-253 | |
| 人CD71磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-046-201 | |
| 人CD235a（血型糖蛋白A）磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| Mini & MidiMACS起始试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Omiget | Omn-02 |
| 逆转录 | All-In-One 5X RT预混液 | ABM | G592 |
| qRT-PCR | BlasTaq 2X qPCR预混液 | ABM | G891 |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | 免疫染色洗涤液 | Beyotime | P0106 |
| 免疫染色封闭液 | Beyotime | P0102 | |
| ZFPM1兔多克隆抗体 | ABclonal | A18183 | |
| 免疫荧光染色试剂盒（Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG） | Beyotime | P0180 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | MBD0015 | |
| 蔡司LSM 880 AxioObserver共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| 细胞分级分离 | 线粒体分离试剂盒 | Thermo Scientific | 89874 |
| 免疫共沉淀 | 经典磁性蛋白A/G免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒 | Epizyme | YJ201 |
| 正常兔IgG | Cell Signalling Technology | 2729 | |
| 小鼠对照IgG | ABclonal | AC011 | |
| 核蛋白提取 | NE-PER核和细胞质提取试剂盒 | Thermo Scientific | 78833 |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | V5113 |
| C18分离柱 | Waters | WAT023590 | |
| TMTpro 16plex同位素标记试剂 | Thermo Fisher | A44520 | |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 亲和纯化 | Anti-FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 蛋白质印迹 | PAGE凝胶快速制备试剂盒 | Epizyme | PG112 |
| Tanon High-sig ECL蛋白质印迹底物 | Tanon | 180-501 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Epizyme | LF101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| K562细胞红系分化 | K562细胞系来源、FBS剥夺处理时间、EPO浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods 的 'Culturing and treatment of K562 cell line and HSCs' 部分 |
| HSCs红系/巨核系分化 | CD34+CD90+HSCs来源、扩增条件、分化培养基和天数（Ery 2/4/10/17/24天，MK 3/14天） 阅读提示：Materials and methods 的 'Culturing and treatment of K562 cell line and HSCs' 部分 |
| HSCB敲低/敲除 | shRNA质粒（sc-75306-SH）或CRISPR/Cas9 KO质粒（sc-409377）及HDR质粒（sc-409377-HDR）、转染试剂、筛选浓度和时间 阅读提示：Materials and methods 的 'Gene knockdown, overexpression, and knockout' 部分 |
| 抑制剂处理 | ruxolitinib（300 nM）、wortmannin（200 nM或100 nM）、lonafarnib（2 μM）、MG132（10 μM）、KHS101（5 μM或4 μM）的处理时间和溶剂 阅读提示：Materials and methods 的 'Culturing and treatment of K562 cell line and HSCs' 部分 |
| FOG1核转位检测 | 细胞质/核分级分离方法、Western blotting检测C-FOG1和N-FOG1、免疫荧光（K562） 阅读提示：Materials and methods 的 'Separation of cytosolic and mitochondrial fractions'、'Western blotting'、'Immunofluorescence assay' 部分 |