分离与分化脂肪细胞
获得成熟的脂肪细胞用于与乳腺癌细胞共培养以建立CAA模型。
从乳腺癌手术标本中分离原代前脂肪细胞，通过诱导培养基处理15天使其分化为成熟脂肪细胞；同时3T3-L1前脂肪细胞也诱导分化为成熟脂肪细胞。
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癌症相关脂肪细胞通过LIF/CXCLs正反馈环路促进乳腺癌的侵袭和转移
Cancer-associated adipocytes promote the invasion and metastasis in breast cancer through LIF/CXCLs positive feedback loop.
实验完整度
高研究包含体外共培养模型、临床样本分析及体内尾静脉转移模型，使用功能验证（中和抗体、siRNA、抑制剂）和机制验证（信号通路分析）确认LIF/CXCLs正反馈环路。
主要模型
人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、BT549、MCF-7） 人乳腺上皮细胞系MCF10A 人原代脂肪细胞及3T3-L1前脂肪细胞 小鼠乳腺癌细胞系4T1 Balb/c小鼠尾静脉转移模型
重点核对
LIF重组蛋白浓度20 ng/mL处理乳腺癌细胞 LIF中和抗体2 μg/mL、CXCL3抗体5 μg/mL处理共培养体系 Stat3抑制剂Stattic 10 μM、ERK1/2抑制剂LY3214996等浓度及处理时间 体内实验中4T1细胞与3T3-L1共培养后经尾静脉注射1×10^6细胞/只，n=6 EC330和SB225002单独或联合给药剂量（1 μM和0.1 μM）及处理时间
摘要
癌症相关脂肪细胞（CAAs）是由癌细胞转化的脂肪细胞，在促进乳腺癌进展中具有重要作用。然而，癌细胞与脂肪细胞之间相互作用的潜在机制仍不清楚。在此，我们报道CAAs和乳腺癌细胞通过分别分泌细胞因子白血病抑制因子（LIF）和C-X-C亚家族趋化因子（CXCLs）进行通信。LIF是由CAAs分泌的一种促炎细胞因子，通过Stat3信号通路促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Stat3的激活诱导肿瘤细胞分泌谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（ELR）基序CXCLs（CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8）。有趣的是，CXCLs反过来激活ERK1/2/NF-κB/Stat3信号级联反应，促进CAAs中LIF的表达。在临床乳腺癌病理样本中，癌旁脂肪组织中LIF的上调与乳腺癌中Stat3的激活呈正相关。此外，我们验证了脂肪细胞增强了乳腺癌细胞的肺转移，并且EC330（靶向LIF）和SB225002（靶向C-X-C运动趋化因子受体2（CXCR2））的组合显著减少了体内乳腺癌细胞的肺转移。我们的发现揭示了脂肪细胞与乳腺癌细胞的相互作用依赖于细胞因子LIF和CXCLs之间的正反馈环路，这促进了乳腺癌的侵袭和转移。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌症相关脂肪细胞与乳腺癌细胞之间的相互作用机制是什么，特别是LIF和CXCLs在其中的作用？
- 核心机制
- CAA分泌的LIF通过Stat3信号促进乳腺癌迁移侵袭，而乳腺癌细胞分泌的CXCLs通过CXCR2/ERK1/2/NF-κB/Stat3信号上调CAA中LIF表达，形成正反馈环路。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定了乳腺癌细胞分泌的CXCLs；体外共培养、中和抗体、抑制剂和siRNA实验验证了LIF/Stat3和CXCLs/CXCR2/ERK1/2功能；体内实验显示联合EC330和SB225002显著减少肺转移。
- 研究意义
- 揭示了脂肪细胞与乳腺癌细胞间由LIF和CXCLs介导的正反馈环路，为乳腺癌治疗提供了新的干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
共培养建立CAA模型
模拟肿瘤微环境中脂肪细胞与乳腺癌细胞的相互作用，观察脂肪细胞向CAA的转化。
使用Transwell小室（孔径0.4 μm）共培养脂肪细胞和乳腺癌细胞24小时，收集条件培养基；检测脂肪细胞标志物和炎症因子表达变化。
验证LIF对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响
确定CAA分泌的LIF是否促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
用rhLIF处理乳腺癌细胞，进行伤口愈合和Transwell迁移/侵袭实验；同时使用LIF中和抗体处理CAA-CM，观察对迁移侵袭和Stat3磷酸化的影响。
确认Stat3信号在LIF诱导作用中的作用
验证LIF通过Stat3信号通路介导乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
使用Stat3抑制剂Stattic和Stat3 siRNA处理乳腺癌细胞，检测在rhLIF或CAA-CM刺激下的迁移和侵袭能力及Stat3磷酸化水平。
探索CAA中LIF的上游信号通路
确定乳腺癌细胞释放的哪些细胞因子激活CAA中的信号通路以诱导LIF表达。
通过RNA-seq分析共培养的MDA-MB-231细胞中差异表达的分泌蛋白基因，锁定CXCLs；用CXCL3和CXCL8重组蛋白处理脂肪细胞，并用抑制剂和中和抗体验证CXCR2/ERK1/2/NF-κB/Stat3通路。
验证CXCLs对CAA的反馈作用
证明乳腺癌分泌的CXCLs通过CXCR2激活ERK1/2信号从而促进CAA表达LIF。
用SB225002（CXCR2抑制剂）和Reparixin（CXCR1/2抑制剂）处理共培养体系，检测LIF mRNA和蛋白水平；并用rhCXCL3/8处理脂肪细胞观察信号激活。
验证LIF对CXCLs的上调作用
确认LIF通过Stat3信号上调乳腺癌细胞中CXCLs的表达。
用rhLIF和Stattic处理MDA-MB-231细胞，或siRNA敲降Stat3，检测CXCL1-3、CXCL8和IL-6的mRNA水平。
体内验证联合抑制效果
评估EC330和SB225002（单用或联用）对CAA促进乳腺癌肺转移的抑制作用。
将共培养的4T1细胞（经EC330和SB225002处理）经尾静脉注射入Balb/c小鼠，2周后分析肺转移结节数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| 含L-谷氨酰胺的RPMI 1640 | Corning | 99-595-CM | |
| MCF10A专用培养基 | Procell | CM-0525 | |
| 脂肪细胞分离 | I型胶原酶 | Solarbio | C8140 |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 31330095 | |
| 脂肪细胞分化 | 胰岛素 | Sigma | 11061-68-0 |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | 28822-58-4 | |
| 罗格列酮 | Sigma | 122320-73-4 | |
| 地塞米松 | Sigma | 50-02-2 | |
| 脂肪细胞鉴定 | 油红O | Solarbio | G1262 |
| 共培养 | Transwell小室（0.4 μm孔径） | Corning | 3415 |
| 细胞功能实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | Corning | 3422 |
| 细胞侵袭实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 细胞增殖实验 | MTT试剂 | Solarbio | M1020 |
| 细胞因子检测 | LIF ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK1107 |
| CXCL1 ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK196 | |
| CXCL2 ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK1264 | |
| CXCL3 ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK1265 | |
| CXCL8 ELISA试剂盒 | MultiSciences | EK108 | |
| 细胞因子处理 | 重组人LIF | Peprotech | 300-05 |
| 重组人CXCL3 | Peprotech | 300-40 | |
| 重组人CXCL8 | Peprotech | 200-08M | |
| LIF中和抗体 | R&D | AB-250-NA | |
| CXCL3中和抗体 | Origene | PP1014P2 | |
| 信号通路抑制剂 | Stattic | Med Chem Express | HY-13818 |
| LY3214996 | Med Chem Express | HY-101494 | |
| PD98059 | Med Chem Express | HY-12028 | |
| SB 203580 | Med Chem Express | HY-10256 | |
| LY294002 | Med Chem Express | HY-10108 | |
| JSH-23 | Med Chem Express | HY-13982 | |
| BAY 11-7082 | Med Chem Express | HY-13453 | |
| T-5224 | Med Chem Express | HY-12270 | |
| TK216 | Med Chem Express | HY-122903 | |
| TAT-DEF-Elk-1 | Med Chem Express | HY-P2262A | |
| SB225002 | Med Chem Express | HY-16711 | |
| Reparixin | Med Chem Express | HY-15251 | |
| EC330 | Med Chem Express | HY-100949 | |
| SB-505124 | Abmole | M2250 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | TaKaRa | T9108 |
| RT-qPCR | ReverTra Ace® q-PCR RT试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 |
| SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒 | TaKaRa | DRR820A | |
| siRNA转染 | Lipofectamine™ 2000 | Thermo Fisher | 11668027 |
| Western blot | Stat3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 |
| pY705-Stat3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| pS536-NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| ERK1/2抗体 | Affinity Biosciences | AF0155 | |
| pT202/Y204-ERK1/2抗体 | Affinity Biosciences | AF1015 | |
| 免疫组化 | LIF抗体 | Abcam | ab2020 |
| 流式细胞术 | CD44抗体 | Abcam | ab216647 |
| CD90抗体 | Proteintech | 66766-1-Ig | |
| Western blot | β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Cell Signaling Technology | 8059 |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 |
| 流式细胞术 | 荧光标记二抗 | Abcam | ab6854 |
| FACScan流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| MTT检测 | SpectraMax® Paradigm®酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 免疫荧光 | 激光扫描共聚焦显微镜（FV3000） | Olympus | -- |
| 免疫组化 | 光学显微镜 | Olympus Optical | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | BOSTER | AR1176 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脂肪细胞分离与分化 | 原代前脂肪细胞分离方法；分化培养基成分（胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松）及浓度；分化时间15天。 阅读提示：Materials and methods: Isolation and culture of primary human pre-adipocytes; Induced differentiation of pre-adipocytes |
| 共培养体系 | Transwell孔径0.4 μm；共培养时间24小时；细胞比例或接种密度；收集条件培养基的方法。 阅读提示：Materials and methods: Co-culture system and culture medium (CM) production |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞接种密度（Transwell迁移：1×10^4/孔）；刺激因子浓度（rhLIF 20 ng/mL，中和抗体浓度）；血清浓度（0.2%或0.5% FBS）；培养时间24小时；染色及计数方法。 阅读提示：Materials and methods: Wound-healing assay; Transwell cell migration and Matrigel invasion assays |
| 信号通路抑制剂处理 | 抑制剂浓度（Stattic 10 μM，LY3214996等浓度见原文）；处理时间；溶剂对照（DMSO）。 阅读提示：Materials and methods: Cytokines and neutralizing antibodies and inhibitors; Supplementary Table 1 |
| LIF与CXCLs检测 | ELISA试剂盒货号；q-PCR引物序列及内参基因（GAPDH或S18）；样品处理步骤。 阅读提示：Materials and methods: ELISA; Total RNA extraction and real-time quantitative PCR; Supplementary Table 2 |
| 体内转移实验 | 4T1与3T3-L1共培养条件；EC330和SB225002浓度及处理时间；尾静脉注射细胞量（1×10^6）；小鼠品系和数量（n=6）；肺转移分析时间（2周）。 阅读提示：Materials and methods: Tail vein metastasis assays |