细胞培养与谷氨酰胺剥夺
验证谷氨酰胺缺乏对膀胱癌细胞PD-L1表达的影响
将T24和TCCSUP细胞培养在低谷氨酰胺或无谷氨酰胺培养基中，检测PD-L1的mRNA和蛋白水平变化。
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谷氨酰胺缺乏通过激活PD-L1转录诱导膀胱癌免疫抑制
Immunosuppression Induced by Glutamine Deprivation Occurs via Activating PD-L1 Transcription in Bladder Cancer.
实验完整度
高包括体外细胞实验（T24、TCCSUP）、体内异种移植模型、ChIP、Western blot、qPCR、免疫荧光、T细胞共培养实验等多种验证。
主要模型
T24膀胱癌细胞系 TCCSUP膀胱癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植模型 CD3+ T细胞共培养体系
重点核对
T24和TCCSUP细胞在低谷氨酰胺或谷氨酰胺缺乏培养基（50、25、0 mg/L；对照：300 mg/L）中培养 谷氨酰胺剥夺时间点：T24细胞3-48小时，TCCSUP细胞3-72小时 信号通路抑制剂浓度：AZD9291（4 μM）、U0126（T24：8 μM，TCCSUP：20 μM）、SCH772984（T24：1 μM，TCCSUP：0.25 μM）、SP600125（20 μM） 体内异种移植模型：T24细胞（7×10^6）注射于BALB/c裸鼠背部，瘤内注射PBS或谷氨酰胺（1.5 g/L，20 μl/部位，每3天一次，共6次） T细胞共培养：T24/TCCSUP细胞与CD3+ T细胞共培养15小时，PMA/Iono刺激5小时，ELISA检测IFN-γ
摘要
摘要
很少有研究报道肿瘤微环境中的营养物质是否能够调节PD-L1的表达。由于肿瘤细胞常处于低谷氨酰胺环境中，我们研究了膀胱癌细胞在谷氨酰胺缺乏条件下PD-L1的表达。通过qPCR、Western blot和免疫荧光分析研究了谷氨酰胺缺乏下PD-L1的表达以及EGFR/MEK/ERK/c-Jun信号通路的激活。通过ChIP评估了c-Jun介导的PD-L1基因转录调控。在T24细胞、TCCSUP细胞以及有或无谷氨酰胺补充的BALB/c小鼠中评估了PD-L1的表达和EGFR/MEK/ERK/c-Jun信号通路的激活。此外，通过ELISA研究了谷氨酰胺缺乏下PD-L1表达对T细胞功能的影响。谷氨酰胺缺乏使PD-L1的表达和EGFR/MEK/ERK/c-Jun通路的激活升高，并且c-Jun富集在PD-L1的增强子区域。通过抑制EGFR/MEK/ERK/c-Jun通路，PD-L1的表达显著受损，而激活该信号通路则使其升高。此外，在体外和体内，谷氨酰胺补充降低了升高的PD-L1表达和MEK/ERK/c-Jun信号通路的激活。膀胱癌细胞中谷氨酰胺缺乏引起的PD-L1上调可降低T细胞产生IFN-γ。谷氨酰胺缺乏通过EGFR/MEK/ERK/c-Jun通路上调PD-L1的表达，从而损害T细胞功能。
关键词：谷氨酰胺缺乏，PD-L1，膀胱癌，T细胞，MEK/ERK/c-Jun信号通路
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 谷氨酰胺缺乏是否能通过激活EGFR/MEK/ERK/c-Jun信号通路上调膀胱癌细胞中PD-L1的表达，并影响T细胞功能？
- 核心机制
- 谷氨酰胺缺乏通过激活EGFR/MEK/ERK/c-Jun信号通路，使c-Jun富集于PD-L1增强子区域，从而转录上调PD-L1表达。
- 主要证据
- 体外实验中，谷氨酰胺缺乏上调T24和TCCSUP细胞中PD-L1 mRNA和蛋白水平，并激活EGFR/MEK/ERK/c-Jun通路；ChIP证实c-Jun结合PD-L1增强子；抑制剂阻断该通路可逆转PD-L1上调；体内异种移植模型中，谷氨酰胺补充降低PD-L1表达和通路激活；共培养实验中，谷氨酰胺缺乏的膀胱癌细胞降低T细胞IFN-γ产生。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种新的PD-L1表达调控机制，有助于理解癌细胞在谷氨酰胺缺乏环境中促进生存和免疫逃逸的策略，可能为靶向治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
信号通路激活检测
探究谷氨酰胺缺乏是否激活EGFR/MEK/ERK/c-Jun信号通路
通过Western blot和免疫荧光检测谷氨酰胺缺乏后pEGFR、pMEK、pERK、pc-Jun的蛋白水平。
c-Jun结合PD-L1增强子验证
验证c-Jun是否直接结合PD-L1增强子区域以调控PD-L1转录
ChIP实验检测谷氨酰胺缺乏条件下c-Jun与PD-L1增强子的结合富集情况，并使用MEK/ERK/c-Jun抑制剂处理后观察富集变化。
信号通路抑制剂验证
验证抑制EGFR/MEK/ERK/c-Jun通路是否逆转PD-L1上调
使用EGFR抑制剂AZD9291、MEK抑制剂U0126、ERK抑制剂SCH772984、c-Jun抑制剂SP600125处理T24和TCCSUP细胞，检测通路蛋白和PD-L1水平。
谷氨酰胺恢复实验
验证补充谷氨酰胺能否逆转谷氨酰胺缺乏引起的PD-L1上调及通路激活
谷氨酰胺缺乏处理后再更换为正常培养基，检测PD-L1和通路蛋白水平。
体内异种移植模型验证
验证体内补充谷氨酰胺对肿瘤组织中PD-L1表达及通路激活的影响
BALB/c裸鼠皮下注射T24细胞建立移植瘤模型，瘤内注射谷氨酰胺或PBS，检测PD-L1表达和通路激活。
T细胞功能检测
验证谷氨酰胺缺乏诱导的PD-L1上调对T细胞功能的影响
T24和TCCSUP细胞在谷氨酰胺缺乏条件下预处理，并与CD3+ T细胞共培养，检测IFN-γ产生。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | T24细胞系 | Typical Culture Preservation Commission Cell Bank (Shanghai, China) | RRID: |
| TCCSUP细胞系 | Procell (Wuhan, China) | RRID: | |
| 抑制剂处理 | AZD9291 | MCE | HY-15772 |
| U0126 | MCE | HY-12031 | |
| SCH772984 | MCE | HY-50846 | |
| SP600125 | MCE | HY-12041 | |
| 茴香霉素 | MCE | HY-18982 | |
| 重组人EGF | Novus | -- | |
| Western blot | BCA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光试剂盒 | Millipore | -- | |
| HRP标记二抗 | JacksonImmunoResearch | -- | |
| 抗PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 | |
| 磷酸化EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 4267 | |
| 磷酸化MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 8727 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 3270 | |
| c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| GAPDH抗体 | Sigma-Aldrich | G9545 | |
| 免疫荧光 | Cy3偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | SPE | |
| 冷冻切片机 | SLEE International, Inc. | -- | |
| qPCR | TRIzol | Takara | 9109 |
| PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | RR037A | |
| SYBR Green PCR预混液 | Takara | -- | |
| Roche LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| ChIP | Dynal蛋白G磁珠 | Thermo | 10003D |
| c-Jun (60A8)兔单克隆抗体 | CST | 9165 | |
| 同型对照兔单克隆抗体IgG | CST | 3900 | |
| T细胞功能 | 人IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与谷氨酰胺剥夺 | 细胞系（T24和TCCSUP）的来源、培养条件（37°C, 5% CO2）、谷氨酰胺浓度（低、无、对照300 mg/L）、处理时间（T24 24小时，TCCSUP 15小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and Glutamine Deprivation; Figure 1 |
| 信号通路抑制剂处理 | 抑制剂名称、浓度（AZD9291 4 μM，U0126 T24 8 μM/TCCSUP 20 μM，SCH772984 T24 1 μM/TCCSUP 0.25 μM，SP600125 20 μM）、处理时间（T24 24小时，TCCSUP 15小时） 阅读提示：Materials and Methods: Assays of Inhibitor Treatment; Figures 3-5 |
| 谷氨酰胺恢复实验 | 恢复时间（T24：24小时剥夺后恢复24小时；TCCSUP：15小时剥夺后恢复24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and Glutamine Deprivation; Figure 7A,B |
| 体内异种移植模型 | 动物品系（BALB/c裸鼠，4-5周龄）、细胞注射量（7×10^6）、瘤内注射谷氨酰胺浓度（1.5 g/L）、注射体积（20 μl/部位）、频率（每3天一次，共6次） 阅读提示：Materials and Methods: Glutamine Supplementation Assay in an in vivo Xenograft Model; Figure 7C-E |
| T细胞功能检测 | 共培养细胞数量（T24/TCCSUP 5×10^5，T细胞3×10^5）、处理时间（U0126处理24小时，共培养15小时）、刺激条件（PMA/Iono 5小时）、检测IFN-γ的方法（ELISA） 阅读提示：Materials and Methods: IFN-γ Analysis of T Cells; Figure 8 |
| Western blot | 一抗稀释度未明确、二抗稀释度1:10,000，内参GAPDH，蛋白上样量未明确 阅读提示：Materials and Methods: Western Blot Analysis |