circTIAM1的鉴定与特征分析
验证circTIAM1的环状结构、稳定性及亚细胞定位
通过Sanger测序、发散/收敛引物PCR、RNase R处理、ActD处理及核质分离实验鉴定circTIAM1。
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阐明circTIAM1通过miR-485-3p/PLCB1通路在广灵大尾羊脂肪细胞增殖和分化中的作用
Elucidating the Role of circTIAM1 in Guangling Large-Tailed Sheep Adipocyte Proliferation and Differentiation via the miR-485-3p/PLCB1 Pathway.
实验完整度
高包含细胞模型（绵羊原代脂肪细胞）、293T细胞双荧光素酶报告实验、功能验证（过表达/干扰）及机制验证（ceRNA互作）等多层级证据。
主要模型
绵羊原代脂肪细胞 293T细胞 广灵大尾羊（尾脂肪组织来源）
重点核对
绵羊原代脂肪细胞分离自1月龄广灵大尾羊尾脂肪组织 circTIAM1过表达质粒pCD2.1-circTIAM1和干扰siRNA si-circTIAM1-1的转染效率 miR-485-3p mimic和inhibitor的工作浓度为20 pmol/L 双荧光素酶报告实验共转染miR-485-3p mimic或NC后48小时检测荧光素酶活性 细胞分化诱导时间：8天（油红O染色）
摘要
脂肪组织是重要的能量储存器官，受到包括环状RNA在内的多种因素的精细调控，环状RNA在调节脂肪发育和脂质代谢中发挥重要作用。因此，本研究旨在通过研究circTIAM1、miR-485-3p及其靶基因PLCB1的参与，阐明绵羊脂肪细胞增殖和分化的调控机制。通过先前的测序数据，在绵羊脂肪细胞中鉴定出circTIAM1，并阐明了其环化机制，确认其定位于细胞质。RNase R处理和转录抑制剂实验表明，circTIAM1比线性RNA更稳定。此外，circTIAM1促进绵羊脂肪细胞的增殖和分化。进一步地，生物信息学分析表明miR-485-3p与circTIAM1之间存在强相互作用。进一步的实验显示，miR-485-3p通过抑制PLCB1抑制脂肪细胞增殖和分化，而circTIAM1通过竞争性结合减轻其抑制作用。总之，我们的研究阐明了circTIAM1通过miR-485-3p-PLCB1通路调控广灵大尾绵羊脂肪细胞增殖和分化的机制，为深入研究脂肪代谢调控提供了新视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circTIAM1如何通过miR-485-3p/PLCB1通路调控广灵大尾羊脂肪细胞的增殖和分化？
- 核心机制
- circTIAM1作为ceRNA竞争性结合miR-485-3p，解除miR-485-3p对PLCB1的抑制作用，上调PLCB1表达，从而促进脂肪细胞增殖和分化。
- 主要证据
- 通过RNase R和ActD处理确认circTIAM1稳定性；qRT-PCR和Western blot显示circTIAM1促进增殖标志基因（Cyclin D3、CDK4等）和分化标志基因（PPARγ、FABP4等）表达；双荧光素酶报告实验验证miR-485-3p与circTIAM1及PLCB1 3'UTR的结合；共转染实验证明circTIAM1逆转miR-485-3p的抑制作用。
- 研究意义
- 为绵羊脂肪沉积中的circRNA调控网络提供见解，为未来研究绵羊脂肪代谢调控机制提供重要参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circTIAM1对脂肪细胞增殖的影响
检测circTIAM1过表达或干扰对绵羊脂肪细胞增殖的影响
将pCD2.1-circTIAM1和si-circTIAM1转染至绵羊脂肪细胞，通过qRT-PCR、Western blot、EdU和CCK-8检测增殖标志物和细胞活力。
circTIAM1对脂肪细胞分化的影响
检测circTIAM1对绵羊脂肪细胞分化及脂滴形成的影响
转染circTIAM1过表达或干扰载体后，qRT-PCR和Western blot检测成脂标志基因表达，油红O染色观察脂滴形成。
miR-485-3p对脂肪细胞增殖和分化的影响
检测miR-485-3p对绵羊脂肪细胞增殖和分化的影响
将miR-485-3p mimic和inhibitor转染至绵羊脂肪细胞，通过qRT-PCR、Western blot、EdU和CCK-8检测增殖，油红O染色检测分化。
验证miR-485-3p靶向PLCB1
验证miR-485-3p与PLCB1的靶向结合关系
利用RNAhybrid预测结合位点，构建PLCB1 3'UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体，共转染293T细胞检测荧光素酶活性，并在脂肪细胞中验证miR-485-3p对PLCB1表达的抑制。
验证circTIAM1与miR-485-3p的靶向结合及ceRNA机制
验证circTIAM1作为ceRNA竞争性结合miR-485-3p，并检测其对下游PLCB1表达及脂肪细胞功能的影响
RNAhybrid预测结合位点，构建circTIAM1 WT和MUT荧光素酶报告载体进行双荧光素酶实验；在脂肪细胞中共转染miR-485-3p mimic和circTIAM1过表达载体，检测增殖和分化标志基因及PLCB1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离和培养 | II型胶原酶 | Solarbio | C8150 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1A |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Solarbio | I8450 | |
| 地塞米松 | Solarbio | ID0170 | |
| 胰岛素 | Solarbio | I8040 | |
| 载体构建和细胞转染 | pCD2.1-ciR载体 | Geneseed | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNase R处理 | 核糖核酸酶R | Geneseed | R0301 |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9108 |
| DNA提取 | DNAiso试剂 | Takara | 9770 |
| 核质分离 | PARIS试剂盒 | Invitrogen | AM1921 |
| RNA质量检测 | RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| miRcute Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Tiangen | KR211 | |
| qRT-PCR | TB Green Premix Ex Taq II预混液 | Takara | RR820A |
| miRcute Plus miRNA qPCR试剂盒 | Tiangen | FP411 | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| EdU和CCK-8分析 | Cell-LightTM EdU DNA细胞增殖试剂盒 | RiboBio | C10310-1 |
| CCK-8溶液 | -- | -- | |
| 多功能酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | 蛋白裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Solarbio | P6730 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Solarbio | P1260 | |
| 硝酸纤维素滤膜 | Solarbio | HATF00010 | |
| Cyclin D3抗体 | proteintech | 26755-1-AP | |
| CDK4抗体 | Bioss | bs-0633R | |
| PPARG抗体 | proteintech | 16643-1-AP | |
| C/EBPα抗体 | proteintech | 18311-1-AP | |
| FABP4抗体 | proteintech | 12802-1-AP | |
| 脂联素抗体 | Bioss | bs-0471R | |
| PLCB1抗体 | proteintech | 26551-1-AP | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 羊抗兔IgG H&L/AP二抗 | LI-COR | bs-0295G-AP | |
| 油红O染色 | 油红O工作液 | -- | -- |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 显微镜 | Leica | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 广灵大尾羊的年龄和数量：1月龄，3只；采取电击后放血处死，采集尾脂肪组织 阅读提示：Materials and Methods 4.1 |
| 细胞分离和培养 | II型胶原酶消化条件：37°C、200 rpm、30 min；终止消化用含10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM；离心1000 rpm、10 min 阅读提示：Materials and Methods 4.2 |
| 细胞分化 | 分化培养基成分：89% DMEM、1%青霉素-链霉素、250 μmol/L IBMX、500 μmol/L地塞米松、8 μmol/L胰岛素 阅读提示：Materials and Methods 4.2 |
| 细胞转染 | 转染试剂Lipofectamine 3000；质粒/RNA浓度：miR-485-3p mimic/inhibitor工作浓度为20 pmol/L；转染6 h后更换培养基 阅读提示：Materials and Methods 4.3, 4.4 |
| RNase R处理 | RNase R浓度和孵育条件：5 U/µg、37°C、15 min 阅读提示：Materials and Methods 4.5 |
| ActD处理 | ActD浓度和孵育时间：2 μg/mL、4、8、12、24 h 阅读提示：Materials and Methods 4.6 |
| qRT-PCR | qRT-PCR试剂：TB Green Premix Ex Taq II和miRcute Plus miRNA qPCR kit；循环条件未具体说明，需参照试剂盒说明书 阅读提示：Materials and Methods 4.7 |
| EdU和CCK-8分析 | 细胞种植密度：96孔板均匀种植；CCK-8检测时间点：转染后0、12、24、36、48 h；加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，测定450 nm吸光度 阅读提示：Materials and Methods 4.8 |
| Western blot | 蛋白提取液含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和PMSF；一抗稀释比例如Cyclin D3 1:2000、CDK4 1:2000、PPARG 1:2000等；二抗1:10000；成像使用Odyssey Clx系统 阅读提示：Materials and Methods 4.9 |
| 油红O染色 | 分化诱导时间：8天；固定：4%多聚甲醛室温2天；染色：油红O工作液30 min；脱色：60%异丙醇60 s 阅读提示：Materials and Methods 4.10 |
| 双荧光素酶报告实验 | 细胞：293T细胞接种12孔板，融合度70%转染；分组：共转染WT/MUT载体与mimic/NC；每组6个重复；转染后48 h检测荧光素酶活性 阅读提示：Materials and Methods 4.12 |
| 统计分析 | 每个实验3个样本，每个样本检测3次；数据以mean ± SEM表示；p < 0.05为显著；使用Student's t-test和单因素方差分析 阅读提示：Materials and Methods 4.13 |