EPC分离与鉴定
获取并验证骨髓来源的EPC细胞模型。
从雄性SD大鼠股骨和胫骨中分离骨髓单个核细胞，用EGM-2MV培养基培养，通过DiI-acLDL和FITC-UEA-I双染及流式细胞术鉴定表面标志物。
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在ox-LDL暴露下，钙池操纵的钙内流激活的自噬通过CAMKK2-MTOR通路保护EPC增殖
Store-operated calcium entry-activated autophagy protects EPC proliferation via the CAMKK2-MTOR pathway in ox-LDL exposure.
实验完整度
高包含细胞增殖检测（RTCA、CCK-8）、自噬流检测（Western blot、GFP-mRFP-LC3）、基因沉默（shAtg7、shStim1）、钙成像、信号通路抑制剂（STO-609）等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPCs） ox-LDL处理的EPC体外模型
重点核对
EPC分离与鉴定：骨髓来源单个核细胞密度梯度离心，DiI-acLDL和FITC-UEA-I双染鉴定 ox-LDL处理浓度和时间：60 μg/ml处理12小时用于机制研究，0-100 μg/ml用于剂量依赖性实验 自噬抑制：Atg7 shRNA慢病毒感染72小时或3-MA（2 mM）预处理 SOCE干预：STIM1 shRNA慢病毒感染72小时，或EGTA（10 mM）、BAPTA-AM（20 μM）预处理20分钟 CAMKK2抑制：STO-609（10 μM）预处理
摘要
改善内皮祖细胞（EPCs）的生物学功能有利于维持内皮稳态和促进血管再内皮化。由于巨自噬/自噬在细胞功能中已被证明是一把双刃剑，其对EPCs的影响仍有待阐明。本研究旨在探讨在高胆固醇血症下，钙池操纵的钙内流（SOCE）激活的自噬在EPCs增殖中的作用和分子机制。我们采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）模拟大鼠骨髓来源的EPCs中的高胆固醇血症。Ox-LDL剂量依赖性地激活自噬流，同时抑制EPC增殖。重要的是，通过沉默Atg7或3-甲基腺嘌呤处理抑制自噬，进一步加重了ox-LDL对增殖的抑制，提示自噬对ox-LDL具有保护作用。有趣的是，ox-LDL增加了STIM1的表达和细胞内Ca2+浓度。钙螯合剂或STIM1缺陷均减弱了ox-LDL诱导的自噬激活，证实了SOCE参与该过程。此外，CAMKK2（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2，β）的激活和MTOR（雷帕霉素机制性靶标[丝氨酸/苏氨酸激酶]）的失活与自噬调节相关。总之，我们的结果揭示了一条新的SOCE-CAMKK2信号通路调控自噬，并为自噬在维持EPC增殖和促进其存活能力中的重要作用提供了新的见解。这可能有助于提高高胆固醇血症患者EPC移植疗效和促进血管再内皮化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ox-LDL暴露下，SOCE激活的自噬在EPC增殖中的作用及分子机制是什么？
- 核心机制
- ox-LDL通过STIM1介导的SOCE增加[Ca2+]i，进而激活CAMKK2（Ser511磷酸化）并抑制MTOR（Ser2448去磷酸化）及其底物RPS6KB，从而诱导保护性自噬，对抗ox-LDL引起的增殖抑制。
- 主要证据
- ox-LDL剂量和时间依赖性激活自噬流（LC3B-II/I比值增加、SQSTM1减少、GFP-mRFP-LC3斑点增多）；抑制自噬（shAtg7或3-MA）加重增殖抑制；敲低STIM1或钙螯合剂（EGTA/BAPTA-AM）减弱自噬激活；STO-609抑制CAMKK2后逆转自噬和MTOR磷酸化变化。
- 研究意义
- 揭示了SOCE-CAMKK2-MTOR信号通路在ox-LDL诱导的自噬中的新作用，为改善EPC存活和移植疗效、促进高胆固醇血症患者血管再内皮化提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测ox-LDL对EPC增殖的影响
确定ox-LDL是否影响EPC增殖及其剂量和时间依赖性。
使用RTCA实时监测和CCK-8法检测不同浓度ox-LDL处理不同时间后的EPC增殖活性。
检测ox-LDL对自噬流的影响
验证ox-LDL是否诱导EPC自噬流激活。
Western blot检测MAP1LC3B-II/I比值和SQSTM1水平，用GFP-mRFP-LC3腺病毒感染后激光共聚焦观察自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）形成。
验证自噬在ox-LDL抑制增殖中的作用
通过抑制自噬，观察对ox-LDL诱导的增殖抑制的影响，判断自噬是否为保护性反应。
通过慢病毒介导的Atg7 shRNA敲低或3-MA药物抑制自噬，再用ox-LDL处理，检测增殖变化。
检测ox-LDL对[Ca2+]i和SOCE的影响
探究ox-LDL是否通过SOCE升高细胞内钙。
使用荧光探针fluo3-AM检测[Ca2+]i，Western blot检测STIM1蛋白表达，并通过STIM1敲低或SOCE抑制剂2-APB验证SOCE参与钙内流。
验证SOCE对ox-LDL诱导自噬的贡献
确定SOCE介导的钙内流是否参与ox-LDL诱导的自噬。
用钙螯合剂（EGTA、BAPTA-AM）预处理或STIM1敲低后，检测自噬标志物变化。
验证SOCE-CAMKK2-MTOR信号通路
探究ox-LDL诱导自噬的下游信号机制。
Western blot检测CAMKK2、AMPK、MTOR和RPS6KB的磷酸化水平，并使用STO-609抑制CAMKK2，观察对自噬和MTOR磷酸化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证自噬流
验证钙信号
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EGM-2MV BulletKit培养基 | Lonza | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | Boster Biological Technology | AR0032 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞鉴定 | DiI标记的乙酰化LDL | Molecular Probes | L3484 |
| FITC标记的荆豆凝集素I | Sigma | L9006 | |
| 抗KDR抗体 | Bioss | ER-1542 | |
| 抗PECAM1抗体 | Bioss | BS-0468R | |
| 抗CD34抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7324 | |
| 抗PROM1抗体 | Bioss | BS-0395R | |
| 增殖检测 | xCelligence实时细胞分析仪（RTCA） | ACEA Biosciences | -- |
| E-板 | ACEA Biosciences | L8 | |
| CCK-8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0038 | |
| 钙检测 | fluo3-AM | -- | -- |
| 基因沉默 | 携带Atg7 shRNA的慢病毒载体 | Hanbio Technology | -- |
| 携带Stim1 shRNA的慢病毒载体 | Gene Pharma | -- | |
| 自噬检测 | GFP-mRFP-LC3腺病毒 | HanBio Technology | -- |
| RT-qPCR | RNAiso试剂 | Takara | D312 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| SYBR Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | RR820A | |
| 免疫印迹 | 细胞裂解液 | Pierce | 89900 |
| 原钒酸钠 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| TBS缓冲液 | Boster Biological Technology | AR0031 | |
| 吐温-20 | Solarbio | T8220 | |
| 抗MAP1LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775S | |
| 抗SQSTM1抗体 | Cell Signaling Technology | 5114S | |
| 抗ATG7抗体 | Cell Signaling Technology | 8558S | |
| 抗STIM1抗体 | Cell Signaling Technology | 5668 | |
| 抗ORAI1抗体 | Cell Signaling Technology | 3280 | |
| 抗磷酸化CAMKK2抗体 | Cell Signaling Technology | 12818 | |
| 抗MTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| 抗磷酸化MTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2971 | |
| 抗RPS6KB抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗磷酸化RPS6KB抗体 | Cell Signaling Technology | 9205 | |
| 抗CAMKK2抗体 | Abcam | ab96531 | |
| 抗AMPK抗体 | Abcam | ab32047 | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | Abcam | ab133448 | |
| 抗ATG5抗体 | Abgent | AP1812a | |
| 抗TRPC1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-15055 | |
| Image Quant TL软件 | GE Healthcare | -- | |
| 凋亡检测 | ANXA5/膜联蛋白V-PE凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 559763 |
| ANXA5-PE | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 51-68981E | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | MoFlo XDP | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C2006 |
| 药物处理 | 氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan Biotechnologies | YB-002 |
| 3-甲基腺嘌呤 | Sigma | M9281 | |
| 巴佛洛霉素A1 | Sigma | B1793 | |
| 氯喹 | Sigma | C6628 | |
| 2-氨基乙基二苯硼酸酯 | Sigma | D9745 | |
| STO-609 | Sigma | S1318 | |
| EGTA | -- | -- | |
| BAPTA-AM | -- | -- | |
| 细胞培养耗材 | 培养板 | Corning | 430639 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与鉴定 | 大鼠品种（SD）、性别（雄性）、体重（150-180 g）、骨髓单个核细胞分离方法（密度梯度离心）、培养基（EGM-2MV BulletKit） 阅读提示：Materials and methods: Isolation and characterization of EPCs |
| ox-LDL处理 | ox-LDL浓度（0-100 μg/ml）、处理时间（0-24 h）、氧化程度（TBARS 12.0 nM MDA/mg protein） 阅读提示：Materials and methods: Ox-LDL preparation; Results: Figure 1, 2 |
| 自噬检测 | MAP1LC3B-II/I比值、SQSTM1水平、Baf（50 nM）或CQ（20 μM）预处理时间（3 h/12 h） 阅读提示：Results: Figure 2, 3; Materials and methods: Immunoblots |
| 增殖检测 | RTCA细胞接种密度、CCK-8处理时间（0, 6, 12, 24 h）、细胞来源（3只大鼠） 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assays |
| 基因沉默 | Atg7和Stim1 shRNA慢病毒感染时间（72 h）、感染复数（MOI=100） 阅读提示：Materials and methods: Gene silencing |
| 钙信号检测 | fluo3-AM浓度、钙测量条件（无钙/加钙）、2-APB浓度 阅读提示：Materials and methods: Fluorescence Ca2+ measurements; Results: Figure 5, 6 |
| 机制验证 | STO-609浓度（10 μM）、预处理时间 阅读提示：Results: Figure 8; Materials and methods: Reagents |