建立结直肠癌异种移植模型
建立可评估QFG对CRC体内作用的肿瘤模型。
将HCT-116细胞与Matrigel混合后接种于BALB/c裸鼠右侧背部皮下，建立皮下异种移植瘤模型。
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清解扶正颗粒通过Sonic Hedgehog通路调控结直肠癌移植瘤小鼠的癌细胞增殖、凋亡和肿瘤血管生成
Qingjie Fuzheng Granules regulates cancer cell proliferation, apoptosis and tumor angiogenesis in colorectal cancer xenograft mice via Sonic Hedgehog pathway.
实验完整度
中包含移植瘤模型中肿瘤生长、IHC和TUNEL检测细胞增殖与凋亡、Western blot验证SHh通路蛋白表达等实验，但缺少体外细胞功能和机制干预等独立验证。
主要模型
HCT-116细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
HCT-116细胞系（2×10^6）与Matrigel混合后皮下植入BALB/c裸鼠 QFG给药剂量：1 g/kg，每周6天，灌胃，持续28天 对照组给予生理盐水灌胃，每组10只小鼠 Western blot检测SHh、Smo、Gli蛋白表达
摘要
背景：Sonic Hedgehog (SHh)信号通路在包括结直肠癌(CRC)在内的多种恶性肿瘤的细胞增殖、凋亡和肿瘤血管生成中发挥关键作用。清解扶正颗粒(QFG)是一种中药复方，已在包括CRC在内的多种癌症治疗中临床应用。在本研究中，我们探讨了QFG通过SHh通路对CRC发挥治疗作用的潜在分子机制。方法：所有实验均使用CRC HCT-116异种移植小鼠模型。小鼠每周6天灌胃给予1 g/kg的QFG或生理盐水，持续28天(4周)。每3天测量体重、肿瘤长度和最短直径。治疗结束时测量肿瘤重量。TUNEL染色法检测肿瘤细胞凋亡。Western blot和免疫组化(IHC)法检测相关蛋白的表达。结果：QFG抑制了肿瘤体积和重量的增加，且对小鼠体重无影响。此外，QFG显著降低了SHh、Smo和Gli蛋白的表达，表明SHh信号受到抑制。因此，促增殖的survivin、Ki-67、Cyclin-D1和CDK4的表达降低，抗增殖的p21的表达升高。肿瘤组织中促凋亡的Bax/Bcl-2比值、cle-caspase-3和TUNEL阳性细胞百分比升高。同时，促血管生成的VEGF-A和VEGFR-2的表达下调。结论：QFG在体内通过抑制SHh通路抑制CRC细胞增殖并促进CRC细胞凋亡和肿瘤血管生成，提示QFG可能成为CRC的潜在治疗药物。关键词：清解扶正颗粒(QFG)、结直肠癌(CRC)、增殖、凋亡、血管生成
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 清解扶正颗粒在结直肠癌异种移植小鼠模型中是否通过Sonic Hedgehog通路抑制肿瘤生长？
- 核心机制
- QFG通过抑制SHh信号通路（降低SHh、Smo、Gli表达），进而下调促增殖蛋白（survivin、Ki-67、Cyclin-D1、CDK4），上调p21，促进凋亡（升高Bax/Bcl-2、cle-caspase-3），并抑制血管生成（下调VEGF-A、VEGFR-2）。
- 主要证据
- 在HCT-116异种移植瘤模型中，QFG处理28天后肿瘤体积和重量显著降低（P<0.01），IHC显示Ki-67、survivin、Cyclin-D1、CDK4表达降低，p21升高；TUNEL阳性细胞率升高，cle-caspase-3、Bax升高，Bcl-2降低；CD31、VEGF-A、VEGFR-2降低；Western blot显示SHh、Smo、Gli表达降低。
- 研究意义
- QFG可能成为CRC的潜在治疗药物，但皮下异种移植模型不适用于筛选抑制肿瘤转移的药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
QFG体内给药及肿瘤生长监测
观察QFG对CRC移植瘤生长的影响。
给QFG组小鼠灌胃1 g/kg QFG，对照组灌胃生理盐水，每周6天，持续28天，定期测量肿瘤体积和体重。
检测肿瘤细胞增殖
评估QFG对CRC细胞增殖的影响。
通过IHC检测增殖标志物Ki-67、survivin、Cyclin-D1、CDK4及p21的表达。
检测肿瘤细胞凋亡
评估QFG对CRC细胞凋亡的影响。
使用TUNEL染色和IHC检测cle-caspase-3、Bax、Bcl-2表达。
检测肿瘤血管生成
评估QFG对CRC肿瘤血管生成的影响。
通过IHC检测CD31、VEGF-A和VEGFR-2的表达。
验证SHh信号通路变化
探究QFG抑制CRC生长的分子机制是否涉及SHh通路。
通过IHC和Western blot检测SHh、Smo、Gli的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 清解扶正颗粒粉 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640完全培养基 | Life Technologies Corp. | C11875500BT |
| 动物模型 | 基质胶 | Corning | 354248 |
| 药物处理 | 生理盐水 | Yuanye Biology | R22173 |
| 凋亡检测 | 原位凋亡检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | TAK-MK500-KI01 |
| 免疫组织化学 | 抗Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | #9027 |
| 抗cle-caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | #9662 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | #4223 | |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | #5023 | |
| 抗survivin抗体 | Protein Tech Group | 10508-1-AP | |
| 抗p21抗体 | Protein Tech Group | 10355-1-AP | |
| 抗CD31抗体 | Protein Tech Group | 11265-1-AP | |
| 抗VEGF-A抗体 | Protein Tech Group | 19003-1-AP | |
| 抗VEGFR-2抗体 | Protein Tech Group | 26415-1-AP | |
| 抗Cyclin-D1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-753 | |
| 抗CDK4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-16637 | |
| 抗SHh抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365122 | |
| 抗Gli抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515781 | |
| 二抗 | -- | -- | |
| ABC试剂 | -- | -- | |
| 显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | 裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂牛奶 | -- | -- | |
| 抗SHh抗体 | Bioss | bs-1544R | |
| 抗Smo抗体 | Bioss | bs-2801R | |
| 抗Gli抗体 | Bioss | bs-1206R | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | #4967 | |
| HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗 | Signalway Antibody | #L3032 | |
| HRP偶联的山羊抗兔IgG二抗 | Signalway Antibody | #L3012 | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | -- | -- | |
| 统计分析 | SPSS软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | BALB/c裸鼠（6周龄，雄性，体重约20–22 g），HCT-116细胞2×10^6与Matrigel等体积混合后皮下注射，肿瘤体积100–300 mm^2时随机分组，每组10只。 阅读提示：见Methods中Animal models and treatment部分。 |
| QFG给药处理 | QFG剂量：1 g/kg，灌胃，每周6天，持续28天；对照组用生理盐水。 阅读提示：见Methods中Animal models and treatment部分及Abstract Methods。 |
| 肿瘤生长监测 | 每3天测量体重和肿瘤长径、短径，计算体积公式V=(A×B^2)/2。 阅读提示：见Methods中Animal models and treatment部分。 |
| 凋亡检测 | 每组3个肿瘤样本，TUNEL染色，随机5个视野，3名观察者盲法计数。 阅读提示：见Methods中TUNEL staining assay部分及图3图注。 |
| 蛋白表达检测 | IHC每组3个样本，Western blot每组4个样本；抗体稀释度：IHC中Cell Signaling抗体1:500，Proteintech抗体1:200，Santa Cruz抗体1:500；Western blot中Bioss抗体1:500，Cell Signaling抗体1:1000，二抗1:5000。 阅读提示：见Methods中Immunohistochemistry assay及Western blot assay部分。 |