建立凋亡肿瘤细胞和巨噬细胞胞葬共培养模型
验证巨噬细胞能否吞噬顺铂诱导的凋亡结直肠癌细胞。
使用GFP标记的CT26和MC38细胞，经45 µM顺铂处理48小时诱导凋亡，与BMDMs按1:3比例共培养4小时，流式细胞术检测F4/80阳性巨噬细胞中GFP阳性比例。
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含有MFGE8的结直肠癌胞外囊泡促进巨噬细胞胞葬作用
Extracellular vesicles containing MFGE8 from colorectal cancer facilitate macrophage efferocytosis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDM共培养）、EV蛋白质组学、CRISPR-Cas9基因敲除、体内腹腔巨噬细胞实验及TCGA临床数据分析，且明确功能与机制验证。
主要模型
CT26小鼠结直肠癌细胞系 MC38小鼠结直肠癌细胞系 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞模型
重点核对
CRC-EVs预处理BMDMs的浓度（10 µg/ml）和时间（24小时） 凋亡肿瘤细胞与BMDMs的比例（1:3）和共培养时间（4小时） 顺铂诱导凋亡的浓度（45 µM）和时间（48小时） 体内实验中CRC-EVs的给药剂量（50 µg/只）和途径（腹腔注射） STAT3抑制剂Stattic（10 µM）和激动剂Colivelin（20 µM）的使用
摘要
背景：结直肠癌（CRC）通常对顺铂治疗耐受，但潜在机制仍不清楚。在肿瘤微环境中，巨噬细胞通过胞葬作用清除化疗药物诱导的凋亡细胞，在抵抗化疗药物的细胞毒性作用中发挥作用。细胞外囊泡（EVs）作为肿瘤微环境中的细胞间通讯介质，在调节胞葬作用以促进耐药性方面的参与尚未得到充分研究。方法：我们构建了表达GFP荧光的CRC细胞系（包括GFP-CT26和GFP-MC38），通过流式细胞术检测巨噬细胞胞葬作用。我们采用多步超速离心法分离纯化CRC分泌的EVs，并通过电子显微镜和纳米流式细胞术对其进行鉴定。进行蛋白质组学分析以鉴定CRC-EVs所携带的蛋白分子。使用CRISPR-Cas9构建MFGE8敲除的CRC细胞系，并通过蛋白质印迹、免疫荧光和流式细胞术在体外和体内实验中验证其效果，确认这些EVs激活巨噬细胞αvβ3-Src-FAK-STAT3信号通路，从而促进胞葬作用。结果：在本研究中，我们发现CRC来源的EVs（CRC-EVs）增强了巨噬细胞对顺铂诱导的凋亡CRC细胞的胞葬作用。对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析显示，在CRC患者中胞葬相关基因MFGE8高表达，提示预后较差。此外，基于质谱的蛋白质组学分析鉴定出CRC-EVs中MFGE8蛋白丰度较高。利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，我们生成了MFGE8敲除的CRC细胞，证明其EVs在体外和体内均不能上调巨噬细胞胞葬作用。此外，我们证明CRC-EVs中的MFGE8通过增加细胞表面αvβ3的表达，激活细胞内Src-FAK-STAT3信号通路，从而刺激巨噬细胞胞葬作用。结论：因此，本研究强调了CRC-EVs携带MFGE8激活巨噬细胞胞葬作用的机制。这种激活促进了顺铂诱导的凋亡CRC细胞的清除，导致CRC对顺铂的耐药。这些发现为化疗药物、EVs抑制剂和胞葬拮抗剂在CRC治疗中的潜在协同应用提供了新的见解。补充信息：在线版本包含补充材料，可访问10.1186/s12964-024-01669-9。关键词：结直肠癌，细胞外囊泡，MFGE8，巨噬细胞，胞葬作用
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌细胞来源的胞外囊泡（CRC-EVs）如何调控巨噬细胞胞葬作用，从而促进对顺铂的耐药性？
- 核心机制
- CRC-EVs携带MFGE8蛋白，上调巨噬细胞表面αvβ3整合素表达，并通过αvβ3-Src-FAK-STAT3信号通路增强巨噬细胞对顺铂诱导的凋亡肿瘤细胞的胞葬作用。
- 主要证据
- 蛋白质组学鉴定出CRC-EVs高丰度MFGE8；CRISPR-Cas9敲除MFGE8后，EVs在体外和体内均不能增强胞葬作用；αvβ3抑制剂Cyclo(-RGDfK)、STAT3抑制剂Stattic和激动剂Colivelin实验证实其依赖性。
- 研究意义
- 揭示了CRC通过分泌EVs逃避顺铂化疗的新机制，为化疗药物联合EVs抑制剂和胞葬拮抗剂治疗CRC提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分离和鉴定CRC-EVs并验证其对胞葬作用的促进作用
验证CRC-EVs能否被巨噬细胞摄取并促进胞葬作用。
通过多步超速离心法从CT26和MC38细胞培养上清中分离EVs，电子显微镜、纳米流式和Western blot鉴定特征。将BMDMs与PKH67标记的EVs孵育观察摄取，并将BMDMs预处理EVs后与凋亡细胞共培养，流式或共聚焦检测胞葬率。
鉴定CRC-EVs中的效应蛋白MFGE8并验证其必要性
确认MFGE8是否为CRC-EVs促进胞葬作用的关键蛋白。
通过质谱蛋白质组学分析CT26-EVs蛋白组成，发现MFGE8高丰度。利用CRISPR-Cas9敲除CT26和MC38细胞中的Mfge8，提取EVs后与BMDMs共培养，检测胞葬率变化。
临床数据分析MFGE8表达与患者预后关联
探讨MFGE8在结直肠癌患者中的表达与预后的关系。
利用TCGA数据库分析597例CRC患者的MFGE8表达，根据FPKM值10.75为分界分组，进行生存分析。
机制验证：αvβ3-Src-FAK-STAT3通路
验证MFGE8通过αvβ3及下游信号通路促进胞葬作用。
使用αvβ3抑制剂Cyclo(-RGDfK)预处理BMDMs，检测EVs诱导的胞葬率及Src、FAK、STAT3磷酸化水平；使用STAT3抑制剂Stattic和激动剂Colivelin进行功能验证。
体内验证：腹腔巨噬细胞胞葬作用
验证CRC-EVs在体内对巨噬细胞胞葬及信号通路的影响。
12周龄C57BL/6小鼠腹腔注射CRC-EVs或MFGE8敲除EVs（50 µg/只）24小时，随后腹腔注射凋亡GFP标记的CRC细胞，4小时后收集腹腔灌洗细胞分析F4/80阳性巨噬细胞的吞噬率和αvβ3表达及p-STAT3水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质组学分析
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biochannel | BC-M-005 |
| 胎牛血清 | Biochannel | BC-SE-FBS01 | |
| 青霉素/链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 巨噬细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 51112-MNAH |
| 诱导凋亡 | 顺铂 | Med Chem Express | HY-17394 |
| 凋亡检测 | FITC-Annexin V/APC-PI凋亡检测试剂盒 | YEASEN | 40302ES60 |
| EV蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| Western blot | CD9抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 |
| CD63抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| TSG101抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | |
| Mitofilin抗体 | Proteintech | 10179-1-AP | |
| MFGE8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271574 | |
| 磷酸化Src抗体 | Cell Signaling Technology | 6943S | |
| 总Src抗体 | Cell Signaling Technology | 2109S | |
| 磷酸化FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3283S | |
| 总FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3285S | |
| 磷酸化STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 总STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| GAPDH抗体 | Abbkine | ABL1025 | |
| 蛋白质组学 | EasyPep™质谱样品制备试剂盒 | ThermoFisher Scientific | A40006 |
| 流式细胞术 | APC-F4/80抗体 | Multi Sciences | AM048005 |
| 共聚焦免疫荧光 | F4/80抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377009 |
| APC偶联二抗 | HuaAn Biotechnology | HA1127 | |
| 含DAPI封片剂 | Solarbio | S2110 | |
| EV标记 | PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒 | -- | -- |
| RNA提取 | Trlquick试剂 | Solarbio | R1100 |
| 逆转录 | 5 × Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biology | AG11706 |
| qPCR | 2x Taq Pro通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-02 |
| 基因编辑 | SpCas9蛋白 | Integrated DNA Technologies | -- |
| P3原代细胞4D-Nucleofector™ X试剂盒 | Lonza | -- | |
| 信号通路抑制 | Cyclo(-RGDfK) | -- | -- |
| Stattic | -- | -- | |
| 信号通路激动 | Colivelin | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：CT26（Procell）和MC38（中科院）；培养基DMEM+10%FBS+1%双抗；培养条件37°C，5% CO2 阅读提示：Methods：Cell lines and cell culture |
| BMDM分化 | C57BL/6小鼠8-12周；M-CSF浓度20 ng/ml；培养7天 阅读提示：Methods：Bone marrow-derived macrophage culture |
| 凋亡细胞诱导 | 顺铂浓度45 µM，处理48小时；凋亡率>80%确认 阅读提示：Methods：Construction of apoptotic tumor cells及Results第一段 |
| EV分离与鉴定 | 多步超速离心：3000×g 15min，10,000×g 30min，100,000×g 3h；鉴定方法：电镜、Western blot（CD9/CD81/TSG101/Mitofilin）、纳米流式 阅读提示：Methods：Extracellular vesicle isolation and characterization |
| 胞葬作用检测（体外） | BMDMs预处理EVs浓度10 µg/ml，时间24小时；凋亡细胞与BMDMs比例1:3，共培养4小时；流式分析F4/80+GFP+细胞百分比 阅读提示：Methods：Flow cytometry及Figure 2E-F图注 |
| 机制验证（αvβ3-STAT3） | Cyclo(-RGDfK)浓度20 µM；Stattic浓度10 µM，预处理30分钟；Colivelin浓度20 µM；Western blot检测p-Src、t-Src、p-FAK、t-FAK、p-STAT3、t-STAT3 阅读提示：Methods：Western blot及Results第五、六段 |
| 体内实验 | C57BL/6小鼠12周龄；EVs剂量50 µg/只（200 µl PBS）；腹腔注射24小时；凋亡细胞2×10^6/只腹腔注射4小时；腹腔灌洗 阅读提示：Methods：In vivo study of peritoneal macrophage efferocytosis及Figure 7图注 |