ACE2下调的鉴定
确定ACE2是否作为连接COVID-19与代谢并发症的关键分子。
对SARS-CoV-2感染的HUVECs进行转录组分析，并结合DisGeNET和Open Targets数据库筛选四个代谢疾病的共享基因，比较这些基因在病毒感染后的表达变化，发现ACE2是持续下调的基因。
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伊马替尼和甲唑酰胺通过提高ACE2酶活性并抑制病毒入侵改善COVID-19诱导的代谢并发症
Imatinib and methazolamide ameliorate COVID-19-induced metabolic complications via elevating ACE2 enzymatic activity and inhibiting viral entry
实验完整度
高包含细胞模型（HUVECs、Vero E6）、动物模型（DIO和hACE2转基因小鼠）及患者样本的多种证据，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
HUVECs细胞系 Vero E6细胞系 DIO胰岛素抵抗小鼠模型 hACE2转基因小鼠模型 COVID-19患者血浆样本
重点核对
HUVECs及Vero E6细胞SARS-CoV-2感染MOI=0.005 DIO小鼠（23周高脂饮食）灌胃给予250 mg/kg伊马替尼或100 mg/kg甲唑酰胺，每日一次，持续4周 hACE2转基因小鼠（6周高脂饮食后）灌胃给予250 mg/kg伊马替尼或100 mg/kg甲唑酰胺，每日一次，持续4周，然后鼻内攻毒4×10^4 FFU SARS-CoV-2，感染7天后检测 肾脏ACE2条件敲除（AAV9-shACE2经肾盂注射）用于验证ACE2依赖性 A779（MasR抑制剂）处理（3 mg/kg每日腹膜内注射，4周）验证ACE2酶活性下游机制
摘要
2019冠状病毒病（COVID-19）是一种全身性疾病，可能在肝脏、肾脏和心血管系统等多个组织中引起严重的代谢并发症。然而，其潜在机制和最佳治疗方法仍不清楚。我们的研究表明，ACE2通路的损伤是将病毒感染与其继发性代谢后遗症联系起来的关键因素。通过基于结构的虚拟筛选和连接图谱数据库，并进行实验验证，我们确定了伊马替尼、甲唑酰胺和哈巴俄苷为ACE2的直接酶激活剂。伊马替尼和甲唑酰胺在胰岛素抵抗状态和SARS-CoV-2感染状态下，以ACE2依赖性方式显著改善体内的代谢紊乱。此外，这三种化合物通过变构抑制ACE2与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合，直接抑制病毒入侵。综上所述，我们的研究表明，通过伊马替尼、甲唑酰胺或哈巴俄苷酶促激活ACE2可能是治疗COVID-19代谢后遗症的一种概念上的新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACE2通路损伤是否以及如何介导COVID-19相关的代谢并发症，以及能否通过激活ACE2改善这些并发症。
- 核心机制
- ACE2酶活性降低导致Ang II积累和Ang-(1-7)减少，进而破坏代谢稳态；伊马替尼和甲唑酰胺直接结合并激活ACE2，通过ACE2/Ang-(1-7)/MasR轴改善代谢，并通过变构抑制ACE2与刺突蛋白结合减少病毒入侵。
- 主要证据
- 在HUVECs和Vero E6细胞中验证ACE2激活剂效果；DIO小鼠和hACE2转基因小鼠模型验证代谢改善和病毒抑制；Biocore实验显示药物直接结合ACE2；coIP实验显示药物减少ACE2与刺突蛋白结合。
- 研究意义
- 激活ACE2酶活性可能是治疗COVID-19及其代谢并发症的新策略，伊马替尼和甲唑酰胺可用于药物再利用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ACE2酶活性降低的验证
在患者和细胞模型中验证ACE2酶活性是否降低。
ELISA检测COVID-19患者血浆中Ang II和Ang-(1-7)比值；检测SARS-CoV-2感染的HUVECs及高脂饮食hACE2转基因小鼠肝/肾中的ACE2表达和酶活性。
ACE2对代谢稳态的作用
验证ACE2过表达能否改善肥胖小鼠的代谢紊乱。
通过AAV9-hACE2在ob/ob小鼠中过表达ACE2，进行GTT、ITT及组织学分析。
ACE2激活剂的筛选
鉴定能够直接激活ACE2的小分子化合物。
使用Tianhe-2超算进行虚拟筛选，结合CMAP数据库，得到15个候选化合物，并通过HUVECs实验验证，最终确定伊马替尼、哈巴俄苷和甲唑酰胺。
直接结合和激活ACE2的验证
确认候选化合物直接结合并激活ACE2。
使用SPR检测化合物与ACE2蛋白的结合亲和力；测量HUVECs中ACE2酶活性。
体内代谢改善效果验证
验证伊马替尼和甲唑酰胺能否改善胰岛素抵抗小鼠的代谢异常，并确认ACE2依赖性。
DIO小鼠给予伊马替尼或甲唑酰胺，进行GTT、ITT、生化分析、组织学染色；使用肾脏条件敲低ACE2的小鼠及MasR抑制剂A779阻断实验。
体内抗病毒效果验证
验证伊马替尼和甲唑酰胺能否改善SARS-CoV-2感染小鼠的代谢缺陷并抑制病毒。
hACE2转基因小鼠食源性肥胖后药物预给药4周，然后感染SARS-CoV-2，检测代谢指标和病毒载量。
体外抗病毒机制验证
验证药物是否抑制病毒入侵并阐明机制。
Vero E6细胞预处理药物后感染SARS-CoV-2，检测病毒RNA和病毒滴度；伪病毒实验检测入侵；coIP检测ACE2与刺突蛋白的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 虚拟筛选 | 天河二号超级计算机 | -- | -- |
| 蛋白质结合分析 | Biacore T100 | GE Healthcare | -- |
| 细胞培养 | F-12K培养基 | Hyclone | -- |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | AG RNAex Pro试剂 | Accurate Biology | AG21102 |
| 反转录 | Evo M-MLV反转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11711 |
| qPCR | SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 |
| ACE2酶活性检测 | ACE2活性检测试剂盒（荧光法） | Abcam | ab273297 |
| Western blot | 抗ACE2抗体 | Abcam | ab15348 |
| 抗FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | #2880 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #4970 | |
| 抗SARS-CoV-2核衣壳抗体 | Sino Biological | #40143-R001 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | #3724 | |
| 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | #8146 | |
| 抗兔IgG HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | #7074 | |
| ELISA | 人血管紧张素II ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E04493h |
| 人血管紧张素-(1-7) ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E14242h | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E04741m | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E04639m | |
| 小鼠血管紧张素II ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E04495m | |
| 小鼠血管紧张素-(1-7) ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E13763m | |
| 小鼠肾损伤分子1（KIM-1）ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E08809m | |
| 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E05071m | |
| 生化检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| SPR | Series S传感器芯片CM7 | GE Healthcare | 10281415 |
| 药物处理 | 伊马替尼 | MedChemExpress | HY-15463 |
| 甲唑酰胺 | MedChemExpress | HY-B0553 | |
| 哈巴俄苷 | MedChemExpress | HY-N0396 | |
| A779 | MedChemExpress | HY-P0216 | |
| DX600 | MedChemExpress | HY-P2222 | |
| 二脒那秦（DIZE） | MedChemExpress | HY-12404 | |
| 细胞因子处理 | 人TNF-α | Sino Biological | 10602-HNAE |
| 人IL-4 | Sino Biological | 11846-HNAE | |
| 人IL-6 | Sino Biological | 10395-HNAE | |
| 人IFN-γ | Sino Biological | 11725-HNAS | |
| SPR | 人ACE2蛋白 | Sino Biological | 10108-H05H |
| 动物实验 | AAV9-CAG-humanACE2-EGFP | PackGene Biotech | -- |
| AAV9-CAG-mACE2shRNA-EGFP | PackGene Biotech | -- | |
| 60%高脂饲料 | Trophic Animal Feed High-Tech Co.,Ltd | TP23300 | |
| 成像 | Vevo3100 | VisualSonics | -- |
| DM 2500B显微镜 | Leica | -- | |
| Leica DMI8荧光显微镜 | Leica | -- | |
| qPCR | LightCycle480 II | Roche | -- |
| 酶活性检测 | SpectraMax 5 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂 | ComWin Biotech | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Millipore | -- | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads Protein G磁珠 | Invitrogen | -- |
| 3×Flag肽 | -- | -- | |
| ELISA | TMB底物 | -- | -- |
| 细胞系 | 人脐静脉内皮细胞 | ATCC | CRL-1730 |
| 人胚胎肾细胞293T | NICR, China | -- | |
| 小鼠肝细胞AML12 | ATCC | CRL-2254 | |
| 非洲绿猴肾细胞Vero E6 | ATCC | CRL-1586 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SARS-CoV-2感染实验中ACE2激活剂处理 | hACE2转基因小鼠的周龄（12周）、高脂饮食持续时间（6周）、药物剂量（250 mg/kg伊马替尼、100 mg/kg甲唑酰胺）、给药方式（灌胃，每日一次，4周）、SARS-CoV-2攻毒剂量（4×10^4 FFU）、感染时间（7天） 阅读提示：STAR Methods中的Animal studies，图6图注 |
| DIO小鼠代谢改善实验 | 小鼠周龄（28周）、高脂饮食持续时间（23周）、药物剂量（同前）、给药方式（灌胃，每日一次，4周）、GTT和ITT时间点（30周和31周）、处死时间（32周） 阅读提示：STAR Methods中的Animal studies，图5图注 |
| 肾脏ACE2敲低验证 | 肾盂注射AAV9-shACE2的剂量（每肾0.5×10^13 GC）、给药恢复时间（2周）、药物处理时间（4周） 阅读提示：STAR Methods中的Animal studies，图5图注 |
| MasR抑制剂A779阻断实验 | A779剂量（3 mg/kg，每日腹腔注射）、处理时间（4周） 阅读提示：STAR Methods中的Animal studies，图5图注 |
| 体外病毒抑制实验 | Vero E6细胞预处理药物浓度（25 μM伊马替尼、100 μM哈巴俄苷、100 μM甲唑酰胺）和预处理时间（6小时）、感染MOI（0.005）和感染时间（42小时） 阅读提示：STAR Methods中的Focus formation assay，图6R图注 |
| 伪病毒入侵实验 | HEK293T/ACE2细胞预处理药物浓度（同前）和时间（6小时）、伪病毒处理时间（66小时） 阅读提示：STAR Methods中的Pseudovirus Entry Assays，图6S图注 |