JUN activation modulates chromatin accessibility to drive TNFα-induced mesenchymal transition in glioblastoma.
包含体外细胞模型、ATAC-seq、RNA-seq、motif分析、功能实验（Transwell）及临床标本IHC等多个独立证据层级，并包含JNKi干预的功能验证和机制验证。
患者来源胶质母细胞瘤干细胞系TPC2-4 人胶质母细胞瘤细胞系U87 小鼠间质亚型胶质母细胞瘤细胞系3399 包含40例WHO IV级胶质母细胞瘤的组织微阵列
TNFα处理浓度和时间（10 ng/ml，24小时） JNK抑制剂JNK-IN-8的使用浓度（1 μM）和处理时间（24小时） 细胞系TPC2-4的来源和培养条件 ATAC-seq和RNA-seq的数据处理参数（hg19基因组、TopHat、Cufflinks等） IHC评分方法和抗体信息（anti-c-Jun、anti-c-Jun phospho S63等）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TNFα能否在体外诱导胶质母细胞瘤干细胞从非间质亚型向间质亚型转化。
使用患者来源的GSC系TPC2-4，经不同浓度（0、5、10、20、50 ng/ml）和不同时间（12、24、36、48小时）的TNFα处理，通过RT-qPCR检测标记基因（TNFAIP3、NFKB1A、CD44、CDH1）表达，确定最佳处理条件（10 ng/ml，24小时）。随后通过RNA-seq验证间质基因表达上调、经典亚型基因下调，Transwell实验验证迁移能力增强。
揭示TNFα处理对胶质母细胞瘤干细胞全基因组染色质可及性的影响。
对对照和TNFα处理的TPC2-4细胞进行ATAC-seq，比较两组间染色质可及性差异，鉴定获得可及性区域（fold change > 2），并进行GO和KEGG富集分析，同时评估相关基因表达变化。
寻找在TNFα诱导的可及性获得区域中富集的转录因子结合基序。
对TNFα诱导的可及性获得区域进行de novo motif分析，发现JUN家族结合基序显著富集。
通过抑制JUN磷酸化，检验JUN活化是否对于TNFα诱导的染色质开放和基因表达上调是必要的。
在TNFα处理的同时联合JNK抑制剂JNK-IN-8处理TPC2-4细胞，通过ATAC-seq和RNA-seq检测染色质可及性和基因表达变化，并验证代表性基因ITGB3和SAMD4A的变化。
确定抑制JUN激活是否能逆转TNFα诱导的间质转化表型。
通过RNA-seq分析JNKi处理后间质基因特征表达变化，RT-qPCR验证关键基因，Transwell实验检测迁移能力变化。
验证基于实验模型的发现是否在临床胶质母细胞瘤标本中具有相关性。
对40例WHO IV级胶质母细胞瘤组织微阵列进行IHC染色，检测c-JUN、p-JUN、CD44、OLIG2表达，并进行相关性分析。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/Ham's F12培养基 | Gibco | 12400024 |
| B27补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| L-谷氨酰胺200 mM | Gibco | 25030081 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Sino Biological | 10014-HNAE | |
| 人表皮生长因子 | Sino Biological | 10605-HNAE | |
| 药物处理 | 肿瘤坏死因子α | Sino Biological | 10602-HNAE |
| JNK抑制剂JNK-IN-8 | MCE | HY-13319 | |
| 药物溶解 | 二甲基亚砜 | Sigma | D8418 |
| 免疫组化 | 抗c-Jun (60A8)兔单克隆抗体 | CST | 9165S |
| 抗c-Jun磷酸化S63抗体[Y172] | Abcam | ab32385 | |
| 抗CD44多克隆抗体 | Proteintech | 15675-1-AP | |
| 抗OLIG2抗体[EPR2673] | Abcam | ab109186 | |
| Vectra Polaris自动定量病理成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| Transwell | 24孔Transwell小室，孔径8 μm | Corning Costar | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | 脱氧核糖核酸酶I | Sigma | 10104159-001 |
| RevertAid逆转录酶 | Thermo Scientific | EP0442 | |
| Ribolock RNA酶抑制剂 | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RT-qPCR | 2× ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-03 |
| LightCycler480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| RNA-seq | Trizol试剂 | life | 15596018 |
| Illumina PE150测序平台 | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库制备试剂盒V2 | Vazyme | TD501-01 |
| IGEPAL CA-630 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系TPC2-4来源、培养基成分（DMEM/F12、B27、bFGF、EGF等）及培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture and compounds |
| TNFα处理 | TNFα浓度（10 ng/ml）、处理时间（24小时） 阅读提示：Results - 3.1及Figure S1 |
| JNK抑制 | JNK-IN-8浓度（1 μM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture and compounds及Figure 3 |
| ATAC-seq | 细胞数量（5×10^4）、裂解缓冲液成分、转座反应及测序平台（Illumina PE150） 阅读提示：Materials and Methods - ATAC sequencing and data analysis |
| RNA-seq | RNA提取试剂、测序平台、比对和定量参数（hg19、TopHat、Cufflinks） 阅读提示：Materials and Methods - RNA sequencing (RNA-seq) and data analysis |
| 免疫组化 | 组织微阵列的40例WHO IV级标本、抗体稀释比例、评分方法 阅读提示：Materials and Methods - Immunohistochemical staining and analysis及Figure 5 |
| Transwell实验 | 细胞数量（5×10^4）、孔径8 μm、培养时间24小时、下室血清浓度（5% FBS） 阅读提示：Materials and Methods - Transwell assay |
