建立获得性仑伐替尼耐药细胞模型
获得对仑伐替尼耐药的HCC细胞模型以研究耐药机制。
通过逐步递增仑伐替尼浓度处理HuH7和PLC/PRF/5细胞，持续6个月，建立耐药细胞株HuH7 LR和PLC/PRF/5 LR，并通过CCK-8评估IC50验证耐药。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抑制EGFR克服肝细胞癌中STAT3-ABCB1信号驱动的获得性仑伐替尼耐药
Inhibition of EGFR Overcomes Acquired Lenvatinib Resistance Driven by STAT3-ABCB1 Signaling in Hepatocellular Carcinoma
实验完整度
高包含体外耐药细胞模型、体内移植瘤模型、临床样本验证，并进行了功能验证（敲低/过表达）和机制验证（信号通路、脂筏）。
主要模型
HuH7细胞及其仑伐替尼耐药株HuH7 LR PLC/PRF/5细胞及其仑伐替尼耐药株PLC/PRF/5 LR Hep1-6小鼠肝癌细胞耐药株 HCC患者肿瘤样本
重点核对
耐药细胞株建立：逐步递增仑伐替尼浓度，HuH7从3 μmol/L升至30 μmol/L，PLC/PRF/5从20 μmol/L升至60 μmol/L 动物模型：皮下或原位移植瘤模型，仑伐替尼剂量10 mg/kg/d 联合治疗：仑伐替尼联合厄洛替尼（各1/3剂量）在体内外协同抑制耐药肿瘤 临床样本：9例HCC患者，根据RECIST1.1分为PR、SD和PD，比较EGFR-STAT3-ABCB1通路表达 外泌实验：FITC标记的仑伐替尼用于检测药物外排
摘要
仑伐替尼是一种多受体酪氨酸激酶抑制剂，最近被批准用于肝细胞癌（HCC）的一线治疗。然而，仑伐替尼的临床获益有限，迫切需要了解其耐药机制。我们在此报告，HCC细胞通过激活EGFR并刺激EGFR-STAT3-ABCB1轴而对仑伐替尼产生耐药性。仑伐替尼耐药伴随着异常的胆固醇代谢和脂筏激活。ABCB1以脂筏依赖性方式被EGFR激活，显著增强了仑伐替尼的外泌，从而介导耐药。此外，HCC临床标本显示EGFR-STAT3-ABCB1通路的激活与仑伐替尼反应之间存在相关性。厄洛替尼是一种EGFR抑制剂，也被证明能抑制ABCB1，抑制仑伐替尼外泌，仑伐替尼和厄洛替尼联合治疗在体外和体内均显示出对HCC的显著协同效应。综上所述，这些发现表征了HCC一线治疗耐药的机制，并提供了一种规避耐药和治疗该疾病的实用方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCC细胞如何获得对仑伐替尼的耐药性，以及是否可以联合用药克服耐药。
- 核心机制
- 仑伐替尼耐药由EGFR激活并通过STAT3上调ABCB1，ABCB1以脂筏依赖性方式增强仑伐替尼外排，导致耐药。
- 主要证据
- 利用耐药细胞模型、异种移植瘤模型和临床标本，通过蛋白质组学、RTK磷酸化芯片、Western blot、免疫荧光等功能和机制实验证明EGFR-STAT3-ABCB1通路被激活并介导耐药；联合厄洛替尼可抑制ABCB1外排并协同增敏。
- 研究意义
- 揭示仑伐替尼获得性耐药机制，提出仑伐替尼联合厄洛替尼的治疗策略，以克服耐药并改善患者获益。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定参与耐药的信号通路
识别介导仑伐替尼耐药的关键分子和信号通路。
通过TMT蛋白质组分析和磷酸化RTK芯片比较耐药和敏感细胞，发现EGFR和ABCB1上调，并通过Western blot验证EGFR下游STAT3等通路激活。
验证ABCB1介导仑伐替尼外排
确证ABCB1通过促进药物外排介导耐药。
通过LC-MS测量培养上清中仑伐替尼浓度，并使用FITC标记的仑伐替尼进行外排实验，检测耐药细胞外排增加。
验证联合用药的协同效应
评估仑伐替尼联合厄洛替尼是否能克服耐药并具有协同作用。
处理耐药细胞和异种移植瘤模型，通过CCK-8、克隆形成、TUNEL、免疫组化等评估效果，并计算联合指数（CI）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与药物处理 | 仑伐替尼 | Selleck | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 脂质去除胎牛血清 | Biowest | S181L | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA定量 | Nanodrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 反转录 | PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | -- |
| 实时荧光定量PCR | SYBR Green荧光染料 | Takara | -- |
| ABI PRISM 7900序列检测系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗STAT3抗体 | CST | 9139 | |
| 抗p-STAT3抗体 | CST | 4113 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 2118 | |
| 抗ABCB1抗体 | CST | 13978 | |
| 抗EGFR抗体 | CST | 4267 | |
| 抗pEGFR抗体 | CST | 3777 | |
| 抗AKT抗体 | CST | 4685 | |
| 抗pAKT抗体 | CST | 4060 | |
| 抗ERK抗体 | CST | 4695 | |
| 抗pERK抗体 | CST | 4370 | |
| 抗CAV1抗体 | Proteintech | 66067-1-Ig | |
| 抗FLOT1抗体 | ABclonal | A6220 | |
| 抗CEBPD抗体 | Abcam | ab65081 | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗pEGFR抗体 | CST | 3777 |
| 抗EGFR抗体 | CST | 4267 | |
| 抗ABCB1抗体 | CST | 13978 | |
| 抗STAT3抗体 | ABclonal | A19566 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | CST | 9664 | |
| 免疫荧光 | 抗pEGFR抗体 | CST | 3777 |
| 抗CAV1抗体 | Proteintech | 66067-1-Ig | |
| 抗ABCB1抗体 | CST | 13342 | |
| Alexa Fluor 488荧光染料 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| Alexa Fluor 555荧光染料 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| 徕卡共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 分子克隆 | pCDH-puro表达载体 | System Biosciences | -- |
| pLKO.1 TRC载体 | Sigma | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 胆固醇测定与染色 | 胆固醇检测试剂盒 | Applygen Technologies, Inc. | E1005 |
| 胆固醇检测试剂盒 | Abcam | ab133116 | |
| 仑伐替尼外排实验 | FITC标记的仑伐替尼 | 西安瑞禧生物科技有限公司 | -- |
| DiI染料 | -- | -- | |
| 活细胞工作站 | -- | -- | |
| 药物处理 | 厄洛替尼 | -- | -- |
| Stattic（STAT3抑制剂） | -- | -- | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | 串联质谱标签 | -- | -- |
| 信号通路分析 | 磷酸化受体酪氨酸激酶芯片 | R&D Systems | -- |
| 统计与数据分析 | GraphPad Prism 8.0统计软件 | -- | -- |
| 图片定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 脂筏破坏 | 甲基-β-环糊精 | -- | -- |
| 脂筏提取 | 脂筏提取试剂盒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞模型建立 | 起始浓度、递增方案、耐药株命名 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture |
| 细胞活力测定 | 细胞接种密度、处理时间、浓度范围 阅读提示：Materials and Methods, Cell viability assay |
| 分子表达检测 | 抗体号、PCR引物序列、内参基因 阅读提示：Materials and Methods, Western blotting, RNA isolation, reverse transcription, and qPCR |
| 外排实验 | FITC-仑伐替尼浓度、标记时间、观察时间 阅读提示：Materials and Methods, Lenvatinib efflux assay and concentration measurement |
| 体内治疗实验 | 细胞接种数量、肿瘤体积阈值、给药剂量和频率 阅读提示：Materials and Methods, In vivo treatment studies |