抗体产生与筛选
从免疫的恒河猴中获得靶向人PSGL-1的抗体。
用DNA疫苗、K562细胞疫苗和PSGL-1-ECD-Fc蛋白疫苗免疫恒河猴，分离PBMC，分选记忆B细胞，通过ELISA筛选阳性孔，克隆并表达抗体基因。获得RH001-6和RH001-22两个特异性抗体。
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一种非人灵长类来源的抗P-选择素糖蛋白配体-1抗体通过缓解炎症反应减轻急性胰腺炎
A non-human primate derived anti-P-selectin glycoprotein ligand-1 antibody curtails acute pancreatitis by alleviating the inflammatory responses
实验完整度
高包含抗体开发与体外功能验证、两种动物模型体内药效评估及安全性评价等多个独立证据层级。
主要模型
THP-1细胞 HUVEC细胞 BALB/c nude小鼠雨蛙素联合LPS诱导的AP模型 C57BL/6J小鼠L-精氨酸诱导的AP模型
重点核对
RH001-6和RH001-22与PSGL-1的结合亲和力 RH001-6在THP-1细胞实验中阻断P-选择素与PSGL-1结合的浓度梯度 小鼠AP模型中RH001-6和4RA10的给药剂量与时间 小鼠AP模型中用于评估胰腺损伤的组织学评分和血清淀粉酶水平
摘要
急性胰腺炎(AP)是一种以胰腺炎症紊乱为特征的破坏性疾病。P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在炎症部位粘附过程的初始步骤中起着关键作用，阻断PSGL-1可能赋予有效的抗炎作用。在本研究中，我们产生了两种能够有效靶向人PSGL-1的非人灵长类来源的单克隆抗体，RH001-6和RH001-22，它们是从免疫的恒河猴中筛选出来的。我们发现，RH001-6能有效阻断P-选择素与PSGL-1的结合，并在体外消除白细胞与内皮细胞的粘附。在体内，我们证实了RH001-6在雨蛙素和L-精氨酸诱导的AP模型中均能缓解炎症反应和胰腺损伤。我们还评估了RH001-6在小鼠中治疗后的安全性，并证实RH001-6在体内不会引起任何显著的病理损伤。总之，我们开发了一种新型的、高特异性的非人灵长类来源的PSGL-1阻断抗体，命名为RH001-6，它能中断PSGL-1与P-选择素的结合，并减弱AP期间的炎症反应。因此，RH001-6极有可能被进一步开发为针对急性炎症性疾病(如AP)的治疗药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发非人灵长类来源的抗人PSGL-1单克隆抗体，并验证其是否通过减轻炎症反应来缓解急性胰腺炎。
- 核心机制
- RH001-6通过阻断PSGL-1与P-选择素的结合，抑制白细胞与内皮细胞的粘附、减少免疫细胞浸润，并抑制NF-κB信号通路，从而减轻炎症反应和胰腺损伤。
- 主要证据
- 在体外，RH001-6能够阻断P-选择素与PSGL-1结合并抑制THP-1细胞与HUVEC粘附；在体内两种AP模型（雨蛙素+LPS和L-精氨酸）中，RH001-6治疗降低了血清淀粉酶和炎症细胞因子水平，减轻了胰腺组织损伤，并抑制了NF-κB通路磷酸化。
- 研究意义
- RH001-6可能被开发为治疗急性胰腺炎及其他急性炎症性疾病的新型治疗性抗体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
验证RH001-6和RH001-22是否能阻断PSGL-1与P-选择素的结合并抑制白细胞与内皮细胞粘附。
使用流式细胞术检测THP-1细胞与P-选择素的结合，以及细胞粘附实验检测THP-1与HUVEC的粘附能力。比较了不同浓度的RH001-6和RH001-22的效果。
体内药效评估
评估RH001-6在两种急性胰腺炎小鼠模型中的治疗作用。
在雨蛙素+LPS诱导的BALB/c nude小鼠和L-精氨酸诱导的C57BL/6J小鼠AP模型中，通过尾静脉注射RH001-6或对照抗体，评估胰腺组织病理学变化、血清淀粉酶和炎症细胞因子水平，以及免疫细胞浸润情况。
机制探究和安全性评估
探究RH001-6发挥保护作用的分子机制，并评估其体内安全性。
通过Western blot和免疫荧光检测胰腺组织中NF-κB通路相关蛋白的表达和定位；通过H&E染色和血浆生化指标检测主要器官的毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体产生与筛选 | FACSAriaIII流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗体生产 | TrueFect™转染试剂 | Polyplus | -- |
| 蛋白G柱 | GE Healthcare | -- | |
| 抗体亲和力测量 | Series传感器芯片Protein A | -- | -- |
| Series传感器芯片CM5 | -- | -- | |
| 细胞培养和粘附实验 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| CMFDA | Abcam | -- | |
| KPL1 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 4RA10 | BD, Bioscience Pharmingen | -- | |
| 动物实验 | 雨蛙素 | Sigma | -- |
| 脂多糖 | Sigma | -- | |
| L-精氨酸 | -- | -- | |
| 组织学分析 | 抗MPO抗体 | Proteintech | 22225-1-AP |
| 抗F4/80抗体 | Proteintech | 27044-1-AP | |
| 通用两步检测试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-900 | |
| 免疫荧光分析 | 抗p65抗体 | CST | 8242 |
| 抗MPO抗体 | Abcam | ab300650 | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab201340 | |
| 流式细胞术 | BD FACS裂解液 | BD | -- |
| ELISA检测 | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Abcam | ab267580 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Abcam | ab208348 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab100712 | |
| 血清淀粉酶试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-BC-K006-M | |
| Western blot | 抗p-p65抗体 | CST | 3033 |
| 抗p-IκBα抗体 | CST | 2859P | |
| 抗IκBα抗体 | CST | 4814 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | HRP-60008 | |
| Tanon 5500化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| Real-time PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR036A | |
| SYBR Green PCR预混液 | TaKaRa | RR820A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体产生与筛选 | 恒河猴免疫方案、分选门控策略、培养条件 阅读提示：Methods 2.2和2.3节，图1A和1B |
| 体外功能验证 | 细胞系、抗体浓度、孵育时间 阅读提示：Methods 2.6和2.7节，图2 |
| 体内药效评估 | 动物品系、诱导剂剂量和给药方案、抗体给药剂量和时间 阅读提示：Methods 2.8、2.9节，图3和图4 |
| 机制探究和安全性评估 | NF-κB通路检测方法、组织学染色和血浆生化指标 阅读提示：Methods 2.10、2.12、2.13节，图5和图6 |