检测PARylation和PARP1表达水平
验证PARylation在AKI中是否上调及其分布
在人肾活检、小鼠AKI模型（顺铂、缺血再灌注）和HK2细胞（顺铂、H/R）中检测PARP1和PARylation水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PARylation通过RACK1二聚化介导的HIF-1α降解促进急性肾损伤
PARylation promotes acute kidney injury via RACK1 dimerization-mediated HIF-1 α degradation
实验完整度
高包含体外细胞模型、小鼠AKI模型（顺铂和缺血再灌注）、患者肾活检样本三个证据层级，并进行了机制验证（LC-MS/MS、Co-IP、突变体）和功能验证（基因敲低、药物处理）。
主要模型
HK2人肾小管上皮细胞系 顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型 缺血再灌注诱导的急性肾损伤小鼠模型 急性肾损伤患者肾活检组织样本
重点核对
顺铂剂量：20 mg/kg腹腔注射 缺血再灌注时间：双侧肾蒂夹闭40分钟，再灌注24小时 PDD处理：10 mg/kg腹腔注射，顺铂前12小时 A19剂量：2.5、5、10 mg/kg腹腔注射 样本量：每组6-8只小鼠
摘要
Poly(ADP-核糖基)化（PARylation）是一种特定形式的翻译后修饰，主要由poly-ADP-核糖聚合酶1（PARP1）的激活触发。然而，PARylation在急性肾损伤进展中的作用和机制仍不清楚。在此，我们证明了在急性肾损伤小鼠模型中PARP1及其相关的PARylation显著上调，与急性肾损伤患者的肾活检结果一致。PARP1表达的升高可能归因于组蛋白H3赖氨酸4三甲基化。此外，PARylation水平的降低减轻了急性肾损伤小鼠模型中的肾功能障碍。机制上，液相色谱-质谱联用表明PARylation主要发生在活化C激酶1受体（RACK1）上，从而促进其后续的磷酸化。此外，RACK1的磷酸化增强了其二聚化，并加速了泛素化介导的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）降解，从而加重肾损伤。另外，我们确定了一个PARP1蛋白水解靶向嵌合体A19，作为PARP1降解剂，与先前确定的PARP1抑制剂PJ34相比，对肾损伤表现出更优的保护作用。总之，遗传和药物抑制PARylation均减轻了肾损伤，表明PARylated RACK1/HIF-1α轴可能成为AKI治疗的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PARylation在急性肾损伤发病中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- PARP1通过H3K4me3表观修饰上调，催化RACK1的PARylation，促进RACK1的Ser146磷酸化，增强其以二聚化，进而加速HIF-1α的泛素化降解，加重肾小管上皮细胞损伤和炎症。
- 主要证据
- 在HK2细胞和小鼠AKI模型中，通过Western blot、Co-IP、LC-MS/MS、突变体（RACK1 S146G）和免疫荧光等方法验证了PARylation对RACK1磷酸化、二聚化及HIF-1α降解的影响；通过AAV介导的PARP1敲低和PROTAC A19处理验证了降低PARylation的保护作用。
- 研究意义
- PARylated RACK1/HIF-1α轴可能成为AKI治疗的有前景的治疗靶点，PARP1 PROTAC A19的研发为AKI的治疗提供了新的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
研究PARP1上调机制
探究PARP1在AKI中上调的表观遗传机制
利用UCSC数据库分析PARP1启动子区的表观修饰，并在HK2细胞中验证H3K4me3水平，使用MM102、OICR9429、MLL1 siRNA抑制H3K4me3，通过ChIP验证H3K4me3与PARP1的结合。
验证PARylation缺失的功能
确定PARylation缺失对AKI小鼠模型肾损伤和炎症的影响
利用AAV9介导的PARP1敲低小鼠，建立顺铂和缺血再灌注诱导的AKI模型，检测肾功能、组织损伤和炎症指标。
验证PARylation增强的功能
确定增强PARylation是否加重AKI
使用PARG抑制剂PDD增加PARylation，在顺铂诱导的AKI小鼠和HK2细胞中检测肾损伤和炎症指标。
鉴定PARylation底物
寻找介导PARylation作用的关键靶蛋白
使用LC-MS/MS分析顺铂处理并过表达PARP1的HK2细胞中PARylated蛋白，并通过Co-IP验证RACK1与PAR的相互作用。
验证RACK1在急性肾损伤中的作用
证明RACK1在介导PARylation损伤效应中的必要性
在HK2细胞中敲低或过表达RACK1，检测顺铂或H/R诱导的细胞损伤和炎症，以及PDD或PARP1过表达对RACK1二聚化的影响。
探究PARylation促进RACK1二聚化的机制
阐明PARylation如何促进RACK1二聚化
通过Co-IP检测RACK1的磷酸化水平，使用RACK1 S146G突变体验证Ser146磷酸化对二聚化和HIF-1α表达的影响。
验证PARylation促进HIF-1α降解的作用
证明PARylation通过促进RACK1二聚化加速HIF-1α的泛素化降解
在HK2细胞和小鼠模型中检测HIF-1α表达和泛素化水平，使用DMOG抑制脯氨酰羟化酶验证降解机制。
评估PARP1 PROTAC A19的治疗效果
开发并验证PARP1降解剂对AKI的保护作用
合成并鉴定A19，在体外和体内评估其对PARP1降解、肾损伤和炎症的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 肾损伤分子1 | Bioss | bs-21420R |
| 磷酸化P65 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| P65 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| PARP1 | Proteintech | 66520-1-Ig | |
| FLAG标签抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| MYC标签抗体 | Huabio | R1208-1 | |
| 组蛋白H3 | Huabio | M1309-1 | |
| RACK1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| PAR/pADPr抗体 | R&D Systems | 4335-MC-100 | |
| HIF-1α | Immunoway | YT2133 | |
| 磷酸丝氨酸抗体 | Immunoway | YP1878 | |
| H3K4me3抗体 | ABclonal | A22146 | |
| 泛素抗体 | ZENBIO | 382766 | |
| 免疫荧光 | 荧光素标记的LTL | Vector Laboratories | FL-1321 |
| 免疫印迹 | PARP2抗体 | Abways | CY8141 |
| HIF-2α抗体 | Abways | CY5098 | |
| PARP5a抗体 | Biodragon | BD-PN2269 | |
| PARP5b抗体 | Biodragon | BD-PN2396 | |
| β-肌动蛋白 | Servicebio | GB12001-100 | |
| 药物处理 | MM102 | APExBIO | B1582 |
| OICR9429 | APExBIO | B6168 | |
| PJ34 | APExBIO | A3729 | |
| PDD | MedChemExpress | HY-108360 | |
| DMOG | MedChemExpress | HY-15893 | |
| 顺铂 | Sigma-Aldrich | p4393 | |
| 肾功能检测 | 肌酐检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 血尿素氮检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 代谢检测 | NAD+/NADH检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞培养 | HyClone DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 细胞转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| Western blot | IRDye 800偶联二抗 | LI-COR Biosciences | -- |
| LI-COR Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| LC-MS/MS | Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜Talos L120C G2 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞活力 | MTT试剂 | -- | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
| 显微镜 | Olympus IX83显微镜 | Olympus | -- |
| 统计 | SPSS 23.0软件 | IBM | -- |
| 作图 | GraphPad Prism 8.0软件 | GraphPad Software | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；顺铂剂量和给药方式；缺血再灌注时间；对照组设置；每组样本量 阅读提示：Methods 2.3 Animal studies |
| 细胞实验 | 细胞系；培养条件；顺铂或H/R处理浓度和时间；PDD和A19处理浓度和时间 阅读提示：Methods 2.4 Cell lines and culture conditions; 2.11 Cell viability assay |
| 分子机制实验 | RACK1磷酸化位点（Ser146）；RACK1二聚化检测方法；HIF-1α泛素化检测方法；DMOG处理浓度和时间 阅读提示：Methods 2.13 Co-immunoprecipitation; Results 3.6 |
| 药物干预 | PDD剂量和时间；A19剂量和时间；PJ34剂量和时间 阅读提示：Methods 2.3 Animal studies; 2.2 Reagents and materials |
| 统计分析 | 统计方法；样本量；显著性水平 阅读提示：Methods 2.18 Statistical analysis |