体外感染模型建立及铁代谢紊乱分析
确定鼠伤寒沙门菌感染对IPEC-J2细胞铁代谢和细菌增殖的影响。
用MOI=40的鼠伤寒沙门菌感染IPEC-J2细胞，检测不同时间点的细胞内铁含量、铁转运蛋白（DMT1、TfR1、FPN）表达及细菌载量。
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约氏乳杆菌L531通过IRP2通路调节铁稳态和氧化应激改善鼠伤寒沙门菌引起的腹泻
Lactobacillus johnsonii L531 Ameliorates Salmonella enterica Serovar Typhimurium Diarrhea by Modulating Iron Homeostasis and Oxidative Stress via the IRP2 Pathway
实验完整度
高包含体外细胞模型（IPEC-J2、Hela）和体内小鼠模型，并通过siRNA敲低、过表达、铁螯合剂处理等功能验证及Western blot、免疫荧光等机制验证。
主要模型
IPEC-J2细胞 Hela细胞 C57BL/6小鼠模型
重点核对
鼠伤寒沙门菌感染复数MOI=40，约氏乳杆菌L531预处理MOI=10，处理顺序为L531 3h后感染沙门菌 体内实验中，C57BL/6小鼠分为4组，每组10只，L531灌胃7天（5×10^8 CFU），第8天沙门菌攻毒（3×10^6 CFU） 铁螯合剂DFP浓度为50μM，处理30分钟后感染 siRNA敲低IRP2转染48小时，质粒过表达IRP2转染36小时 样本量：体外实验3次独立重复，体内每组6或10只小鼠，统计p<0.05
摘要
鼠伤寒沙门菌已进化出逃避宿主营养免疫的机制，从而利用宿主中的铁来促进细菌生长。然而，鼠伤寒沙门菌诱导铁稳态失调的详细机制以及约氏乳杆菌L531是否能缓解由鼠伤寒沙门菌引起的铁代谢紊乱尚未完全阐明。在此，我们表明鼠伤寒沙门菌在体外和体内激活了铁调节蛋白2、转铁蛋白受体1和二价金属转运蛋白1的表达，并抑制了铁输出蛋白ferroportin的表达，导致铁过载和氧化应激，抑制了关键抗氧化蛋白NF-E2相关因子2、血红素加氧酶-1和超氧化物歧化酶。约氏乳杆菌L531预处理有效逆转了这些现象。在IPEC-J2细胞中，IRP2敲低抑制了鼠伤寒沙门菌诱导的铁过载和氧化损伤，而IRP2过表达则促进了鼠伤寒沙门菌引起的铁过载和氧化损伤。有趣的是，在Hela细胞中，IRP2过表达后，约氏乳杆菌L531对铁稳态和抗氧化功能的保护作用被阻断，表明约氏乳杆菌L531通过IRP2通路减弱了鼠伤寒沙门菌引起的铁稳态破坏和随之而来的氧化损伤，这有助于预防小鼠的鼠伤寒沙门菌腹泻。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鼠伤寒沙门菌如何诱导宿主铁稳态失调，以及约氏乳杆菌L531能否通过调节铁代谢来缓解沙门菌感染引起的腹泻和氧化应激？
- 核心机制
- 鼠伤寒沙门菌通过激活IRP2通路，上调DMT1和TfR1，抑制FPN，导致细胞内铁过载和氧化应激；约氏乳杆菌L531通过抑制IRP2表达，恢复铁转运蛋白的正常表达，减轻氧化应激，从而缓解腹泻。
- 主要证据
- 体外实验显示，鼠伤寒沙门菌感染IPEC-J2细胞增加铁含量和ROS，L531预处理逆转这些变化；敲低IRP2减少铁积累和细菌载量，过表达IRP2则消除L531的保护作用；体内实验中，L531减少小鼠肝脏和粪便中的沙门菌载量，改善腹泻和组织病理损伤，并恢复铁代谢和抗氧化指标。
- 研究意义
- 研究结果为约氏乳杆菌L531在防御鼠伤寒沙门菌感染中的潜在应用提供了策略，并强调了动物源性食品安全的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
铁螯合剂DFP处理验证铁稳态作用
验证铁稳态失调是否促进沙门菌生长和氧化应激。
用铁螯合剂DFP预处理细胞，检测细胞内铁含量、细菌载量、ROS水平及抗氧化蛋白表达。
IRP2功能验证（敲低与过表达）
确定IRP2在沙门菌诱导的铁代谢紊乱和氧化应激中的必要性和充分性。
使用siRNA敲低IRP2或用质粒过表达IRP2，检测铁含量、细菌载量、铁转运蛋白和抗氧化蛋白表达。
L531保护作用验证（体外）
评估约氏乳杆菌L531预处理是否通过IRP2通路缓解沙门菌引起的铁代谢紊乱和氧化应激。
在IPEC-J2和Hela细胞中，用L531预处理3小时，再感染沙门菌，检测铁含量、细菌载量、ROS及IRP2和抗氧化蛋白表达。
体内动物模型验证
验证L531在体内对沙门菌腹泻、铁代谢和氧化应激的改善作用。
用C57BL/6小鼠建立沙门菌感染模型，L531灌胃7天，第8天攻毒，检测腹泻程度、组织病理、铁含量、铁转运蛋白表达和抗氧化指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DME/F-12 1:1培养基 | Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 细胞处理 | 去铁酮 | Solarbio | ID0980 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Solarbio | 539133 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| 免疫荧光 | 含Tween 20的磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1033 |
| 封闭 | 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 |
| 细胞通透 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| 细胞核染色 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 封片 | 抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | S2100 |
| Western blot | 抗SLC40A1抗体 | Bioss | bs-21360R |
| 抗转铁蛋白受体抗体 | Abcam | ab214039 | |
| DMT1兔多克隆抗体 | ABclonal | A10231 | |
| 抗IREB2/IRP2抗体 | Bioss | bs-4484R | |
| 抗鸟头酸酶1抗体 | Bioss | bs-9848R | |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab137550 | |
| HO-1/HMOX1多克隆抗体 | Proteintech | 10701-1-AP | |
| β-actin抗体 | -- | 66009-1-Ig | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | PR30009 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | HS201-01 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 555标记二抗 | Beyotime | A0453 |
| 细菌培养 | LB培养基 | -- | -- |
| MRS琼脂 | Land Bridge | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 铁含量测定 | 亚铁比色测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M |
| 血清铁测定 | 微量血清铁浓度测定试剂盒 | Solarbio | BC1735 |
| 组织铁测定 | 组织铁测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A039-2-1 |
| 抗氧化指标检测 | SOD测定试剂盒 | Beyotime | S0101S |
| T-AOC测定试剂盒 | Beyotime | S0121 | |
| MDA测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1-2 | |
| 铁染色 | FerroOrange探针 | Dojindo | F374 |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| 二氢乙锭测定试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| 反转录 | PrimeScript反转录试剂盒 | TaKaRa | RR047A |
| Western blot | ECL免疫印迹底物 | -- | -- |
| Western blot成像 | Tanon 6200化学发光成像工作站 | Tanon | -- |
| 显微镜 | Nikon A1共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- |
| Nikon Eclipse Ti-U荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| 统计分析 | IBM SPSS统计软件23.0 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞培养与感染 | IPEC-J2和Hela细胞培养条件（DME/F-12，10% FBS，1%青霉素/链霉素），感染复数（S.Typhimurium MOI=40，L531 MOI=10），处理顺序（L531预处理3h，沙门菌感染30min后加庆大霉素） 阅读提示：Methods 2.4, 2.5; Figure 1 legend |
| 铁螯合剂处理 | DFP浓度50μM，处理时间30分钟 阅读提示：Methods 2.5; Results 3.2; Figure 2 legend |
| 基因敲低与过表达 | siRNA序列及转染试剂（siIRP2，Lipofectamine RNAiMAX，转染48h）；过表达质粒构建（pEGFP-C1-IRP2，Lipofectamine 3000，转染36h） 阅读提示：Methods 2.17; Table 1 |
| 体内动物模型 | C57BL/6小鼠（6周龄，雄性，每组10只），L531灌胃剂量5×10^8 CFU/天，持续7天；沙门菌攻毒剂量3×10^6 CFU/只；感染后3天取样 阅读提示：Methods 2.6; Figure 7A |
| 检测指标 | 细胞内铁含量（FerroOrange、亚铁比色法），组织铁（试剂盒），血清铁，细菌载量（平板计数），ROS（DCFH-DA，DHE），抗氧化蛋白（Western blot），氧化应激标志物（SOD、T-AOC、MDA） 阅读提示：Methods 2.9-2.16, 2.18-2.20; Figure legends 1-8 |