建立MPN小鼠模型
诱导MPN表型并观察骨髓纤维化和微环境变化
将携带MPLW515L或Jak2V617F突变的造血干细胞移植到经过致死性照射的受体小鼠中，或使用Jak2V617F转基因小鼠模型。
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骨髓增殖性肿瘤中的TGF-β信号传导促进骨髓纤维化而不破坏造血微环境
TGF-β signaling in myeloproliferative neoplasms contributes to myelofibrosis without disrupting the hematopoietic niche
实验完整度
高包含MPLW515L和Jak2V617F两种小鼠模型、MSC培养与抑制剂处理、CRISPR/Cas9基因编辑、体内JNK抑制剂治疗及组织学分析，进行了功能验证和机制验证。
主要模型
MPLW515L逆转录病毒移植小鼠模型 Jak2V617F转基因小鼠模型 小鼠骨髓间充质基质细胞（MSC）培养体系
重点核对
Osx-Cre介导的Tgfbr2缺失效率（mRNA降低>90%） MPLW515L移植后4-8周骨髓纤维化评分 JNK抑制剂CC-930给药剂量（50 mg/kg，每日两次，持续4周） Cxcl12和Kitlg mRNA表达水平 骨髓和脾脏中HSC数量
摘要
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）与骨髓微环境的显著改变相关，包括关键微环境因子表达降低和骨髓纤维化。在这里，我们通过消融骨髓间充质基质细胞中的TGF-β信号传导，探讨了TGF-β对这些改变的贡献。在Osx-Cre靶向的MSCs中缺失TGF-β信号传导，在MPLW515L和Jak2V617F两种MPN模型中均阻止了骨髓纤维化的发展。相比之下，尽管没有骨髓纤维化，但在间充质基质细胞中缺失TGF-β信号传导并不能挽救MPLW515L诱导的缺陷性造血微环境，如骨髓细胞减少、造血干/祖细胞数量减少、Cxcl12和Kitlg表达降低以及脾脏髓外造血的存在所证明。MPLW515L诱导的骨髓纤维化在Osx-Cre Smad4fl/fl受体中保持完整，表明不依赖SMAD4的TGF-β信号传导介导骨髓纤维化表型。确实，用c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂治疗可阻止MPLW515L诱导的骨髓纤维化的发展。总之，这些数据表明，间充质基质细胞中依赖JNK的TGF-β信号传导负责骨髓纤维化的发展，但不负责MPN中的造血微环境破坏，提示调节骨髓间充质基质细胞中微环境基因表达的信号与诱导纤维化程序的信号是不同的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TGF-β信号在骨髓间充质基质细胞中对MPN骨髓纤维化和造血微环境破坏的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- 非经典SMAD4非依赖的JNK（特别是JNK1）依赖的TGF-β信号通路在MSCs中介导纤维化基因表达和骨髓纤维化发展。
- 主要证据
- 在MPLW515L和Jak2V617F模型中，Osx-Cre介导的MSCs中Tgfbr2缺失阻止骨髓纤维化，但Smad4缺失无效；JNK抑制剂SP600125和CC-930抑制纤维化基因表达和体内骨髓纤维化。
- 研究意义
- 揭示JNK是治疗骨髓纤维化的潜在药物靶点，且纤维化程序与微环境因子调控信号不同。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测骨髓纤维化程度
评估不同基因型小鼠中骨髓纤维化的严重程度
通过网状纤维染色、胶原I/III免疫荧光和Col3a1、Acta2 mRNA表达评估骨髓纤维化。
评估造血微环境功能
测定骨髓细胞、HSPC数量及微环境因子表达
分析骨髓细胞数、表型HSC数量、Cxcl12和Kitlg mRNA表达、脾脏重量和髓外造血。
体外MSC培养和TGF-β刺激
确定TGF-β诱导纤维化基因表达的信号通路
培养小鼠MSC，用TGF-β1和信号通路抑制剂处理，检测纤维化相关基因表达。
基因编辑验证JNK亚型
确定JNK1或JNK2在TGF-β诱导纤维化基因表达中的特异性作用
通过CRISPR/Cas9在MSC中敲除Mapk8（JNK1）或Mapk9（JNK2），再用TGF-β1刺激。
体内JNK抑制剂治疗
验证JNK抑制剂是否能预防MPLW515L诱导的骨髓纤维化
对移植MPLW515L的小鼠口服JNK抑制剂CC-930，评估纤维化程度和血液学参数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | MPLW515L逆转录病毒 | -- | -- |
| 细胞培养 | 转化生长因子-β1 | -- | -- |
| 抑制剂处理 | SP600125（JNK抑制剂） | -- | -- |
| PD99059（MEK抑制剂） | -- | -- | |
| SB202190（p38抑制剂） | -- | -- | |
| pevonedistat（NF-κB抑制剂） | -- | -- | |
| 体内治疗 | CC-930（泛JNK抑制剂） | MedChemExpress | -- |
| 组织学 | 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab34710 |
| 抗III型胶原抗体 | Abcam | ab7778 | |
| 抗TGF-β1（LAP）抗体 | R&D Systems | AB-246-NA | |
| 流式 | PE-抗CD41抗体 | BD Biosciences | MWReg30 |
| 组织学 | Alexa Fluor 647偶联驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭剂 | Life Technologies | -- | |
| 显微镜 | LSM 700显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 定量PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| iScript反转录预混液 | Bio-Rad | -- | |
| TaqMan通用RT预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式 | Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 小鼠促血小板生成素 | -- | -- | |
| 小鼠白细胞介素-3 | -- | -- | |
| 小鼠Flt3配体 | -- | -- | |
| 小鼠干细胞因子 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 基因编辑 | Alt-R化脓性链球菌Cas9核酸酶V3 | IDT | -- |
| Neon转染系统 | Invitrogen | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | MilliporeSigma | -- |
| 抗SMAD2抗体 | Cell Signaling Technology | 5339 | |
| 抗磷酸化SMAD2抗体 | Cell Signaling Technology | 3104 | |
| 抗c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| 抗磷酸化c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 3270 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗JNK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3708 | |
| 抗JNK2抗体 | Cell Signaling Technology | 4672 | |
| 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 组织学 | OCT包埋剂 | Sakura Finetek | -- |
| CryoJane系统 | Leica Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MPLW515L模型 | 照射剂量、移植细胞数、病毒滴度、分析时间 阅读提示：Methods: MPLW515L MPN model |
| Jak2V617F模型 | 移植细胞数、他莫昔芬剂量和给药方式、分析时间 阅读提示：Methods: Jak2V617F MPN model |
| MSC培养和TGF-β刺激 | TGF-β1浓度、抑制剂浓度和处理时间 阅读提示：Methods: Bone marrow MSC culture |
| JNK抑制剂治疗 | CC-930剂量、给药频率和持续时间 阅读提示：Methods: JNK inhibitor treatment in mice |
| 纤维化评分 | 评分标准（WHO标准）、评估者独立性 阅读提示：Methods: Histologic analysis of femur and spleen tissue |