验证3BP2-TLR2相互作用及TLR2信号复合体组成
探究3BP2是否作为TLR2信号复合体成分参与信号传导
在HEK293T细胞中共表达3BP2、TLR2、MyD88、TRAF6等，通过免疫共沉淀检测蛋白相互作用；在原代巨噬细胞中检测3BP2与TLR2的共沉淀及配体诱导的复合体形成。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
端锚聚合酶通过减弱TLR2信号抑制自身炎症
Tankyrase represses autoinflammation through the attenuation of TLR2 signaling
实验完整度
高研究包含细胞水平（HEK293T、巨噬细胞）的分子机制验证（磷酸化、泛素化、蛋白互作），以及小鼠模型（条件敲除）的表型、组织学和遗传拯救实验，多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 条件敲除小鼠（LysM-Cre介导的髓系特异性Tnks/Tnks2敲除，及Sh3bp2三重敲除）
重点核对
TLR2胞内域Y647磷酸化对TLR2信号和稳定性至关重要 3BP2在TLR2信号复合体中招募SRC和SYK 髓系细胞特异性敲除Tnks和Tnks2导致全身性自身炎症 3BP2缺失可逆转Tnks/Tnks2敲除小鼠的炎症表型
摘要
Toll样受体（TLR）信号失调与自身免疫疾病的发病机制有关。在此，我们提供了遗传学证据，表明端锚聚合酶（tankyrase）作为聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）家族的成员，负调控TLR2信号。我们证明，髓系细胞中缺乏端锚聚合酶的小鼠发展为严重的全身性炎症，血清炎症细胞因子水平升高。我们提供了机制证据，表明端锚聚合酶缺乏导致TLR2的酪氨酸磷酸化和激活，并证明TIR结构域内第647位酪氨酸被SRC和SYK激酶磷酸化对TLR2的稳定和信号传导至关重要。最后，我们证明在髓系细胞中缺乏端锚聚合酶的小鼠中观察到的细胞因子产生和炎症升高依赖于衔接蛋白3BP2，而3BP2是SRC和SYK激活所必需的。这些数据表明，端锚聚合酶为TLR介导的先天免疫反应提供了一个检查点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 端锚聚合酶（tankyrase）是否以及如何调控TLR2介导的先天免疫和自身炎症？
- 核心机制
- 端锚聚合酶通过ADP-核糖基化修饰3BP2，促进其经RNF146介导的泛素化降解。3BP2作为TLR2信号复合体组分，招募并激活SRC和SYK激酶，后者磷酸化TLR2 TIR域Y647，增强TLR2稳定性和MyD88结合，促进NF-κB活化和炎症因子产生。
- 主要证据
- 体外实验显示3BP2与TLR2互作，SRC/SYK磷酸化TLR2 Y647；Y647点突变影响TLR2稳定性及与MyD88结合。体内实验显示Tnks/Tnks2髓系敲除小鼠表现全身炎症，血清细胞因子升高，巨噬细胞TLR2信号增强；Sh3bp2缺失可逆转该表型。
- 研究意义
- 揭示端锚聚合酶作为TLR2介导的先天免疫关键检查点，为自身炎症和自身免疫疾病的机制理解及潜在治疗提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定TLR2磷酸化位点及激酶
确定TLR2胞内域酪氨酸磷酸化是否由SRC/SYK介导及其功能意义
构建TLR2胞内域酪氨酸突变体（6YF）和add-back突变体，检测NF-κB报告基因活性；利用质谱鉴定TLR2互作蛋白；用SRC/SYK抑制剂处理细胞检测NF-κB活性；通过免疫沉淀和Western blot检测TLR2酪氨酸磷酸化水平。
分析酪氨酸磷酸化对TLR2稳定性的调控
阐明酪氨酸磷酸化如何影响TLR2蛋白稳定性及泛素化
通过脉冲追踪实验比较野生型和6YF突变体TLR2的半衰期；检测TLR2泛素化水平及与E3泛素连接酶PPP1R11的相互作用。
构建并表征髓系特异性Tankyrase敲除小鼠
研究Tankyrase在体内对免疫稳态和炎症的作用
通过LysM-Cre介导的条件敲除获得小鼠Tnks-/-Tnks2fl/fl LysM-Cre，观察发育、体征和组织病理变化；通过IHC和流式分析鉴定免疫细胞浸润；检测血清细胞因子水平。
分析Tankyrase缺陷巨噬细胞中TLR2信号异常
确定Tankyrase缺失对巨噬细胞TLR2信号通路和细胞因子产生的影响
从WT和KO小鼠骨髓中分离巨噬细胞，用TLR2配体（HKPG或HKSA）刺激，检测IL-6产生、NF-κB核转位、IκBα磷酸化及TLR2、3BP2、SRC/SYK水平；使用激酶抑制剂验证通路依赖性。
遗传拯救实验验证3BP2的关键作用
验证Tankyrase缺失引起的炎症表型是否依赖于3BP2
将Sh3bp2fl/fl等位基因引入Tnks-/-Tnks2fl/fl LysM-Cre小鼠，获得三重敲除小鼠（TKO），比较其与KO小鼠的表型、细胞因子水平和信号通路变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白质相互作用
验证功能变化
评估体内效果
验证免疫效应
鉴定蛋白互作网络
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Wisent | -- | |
| 细胞因子检测 | 小鼠磁珠多重因子检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | MilliporeSigma或RayBiotech | -- | |
| Western blot | 抗磷酸化酪氨酸抗体（4G10） | Millipore | 05-321 |
| 抗TLR2抗体（人） | Cell Signaling Technology | 12276 | |
| 抗TLR2抗体（小鼠） | Cell Signaling Technology | 13744 | |
| 抗磷酸化SRC抗体（Y416） | Cell Signaling Technology | 2101 | |
| 抗SRC抗体 | Cell Signaling Technology | 2109 | |
| 抗磷酸化SYK抗体（Y525/526） | Cell Signaling Technology | 2710 | |
| 抗SYK抗体 | Cell Signaling Technology | 2712 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9242 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗MyD88抗体 | MilliporeSigma | SAB3500472 | |
| 抗FLAG标签抗体 | MilliporeSigma | F3165 | |
| 抗Myc标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗HA标签抗体 | MBL International | M180-3 | |
| 抗PPP1R11抗体 | Abcam | ab171960 | |
| 抗3BP2抗体 | Abnova | H00006452-M01 | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | SYK抑制剂 | Millipore | -- |
| PP2 SRC激酶抑制剂 | Selleckchem | -- | |
| BMS 345541 IKK抑制剂 | Selleckchem | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Plus 微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RT-qPCR | ImProm-II逆转录系统 | Promega | -- |
| Step One Plus 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads Protein A或G磁珠 | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | -- |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B | GE Healthcare | -- |
| Western blot | PVDF膜（Immobilon） | MilliporeSigma | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | -- |
| Aqua Mount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | Olympus IX81倒置显微镜 | Olympus | -- |
| 组织学 | 抗F4/80抗体 | Abcam | ab6640 |
| 抗Mac2抗体 | Cedarlane | CL8942AP | |
| 抗CSF-1R抗体 | Abcam | ab215441 | |
| 抗CD45R抗体 | BD Biosciences | 550286 | |
| 抗MPO抗体 | Abcam | ab9535 | |
| 抗EPX抗体 | Biorbyt | orb5168 | |
| Simple Stain MAX PO检测系统 | Nichirei | -- | |
| DAB底物试剂盒 | Nichirei | -- | |
| 流式细胞术 | LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FACSAria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 抗原微阵列 | FAST硝酸纤维素膜载玻片 | GVS | -- |
| Cy3标记羊抗鼠IgG Fc二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| Cy5标记羊抗鼠IgM二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| Axon 4200A扫描仪 | Molecular Devices | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18 StageTips | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | LipoD293 DNA体外转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- |
| 报告基因实验 | NF-κB荧光素酶报告质粒 | Promega | -- |
| phRL-CMV对照质粒 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 脉冲追踪实验 | Click-IT蛋白质代谢标记试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- |
| AHA（甲硫氨酸类似物） | Invitrogen | -- | |
| Click-IT蛋白质反应缓冲液试剂盒 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 生物素炔基 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因分型 | Wizard SV基因组DNA纯化系统 | Promega | -- |
| GoTaq Green预混液 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和原代巨噬细胞 | BMDM分离和培养方法，培养基（α-MEM），FBS浓度，M-CSF条件培养基（CMG） 阅读提示：Methods中Cell culture部分 |
| 信号通路分析 | TLR2配体（HKSA/HKPG）浓度（107 cells/mL）和刺激时间（0-120分钟） 阅读提示：图1、7、8的图注和对应结果部分 |
| 小鼠模型 | 小鼠基因型（WT, Tnks-/-Tnks2fl/fl LysM-Cre, Tnks-/-Tnks2fl/fl Sh3bp2fl/fl LysM-Cre），年龄（12周龄） 阅读提示：Methods中Mice部分和图4-6的图注 |
| 蛋白质稳定性分析 | 脉冲追踪实验中AHA标记和追踪时间点 阅读提示：Methods中Nonradioactive pulse-chase assay部分 |
| 抑制剂处理 | SYK抑制剂浓度（10-50μM），PP2浓度（10μM），BMS 345541浓度（10μM），处理时间 阅读提示：图7和8的图注及方法部分 |