筛选ASC的去泛素化酶（DUB）
鉴定能够去除ASC泛素化的潜在DUB。
在HEK293T细胞中共转染22种USP家族DUB与ASC和泛素，通过免疫沉淀和免疫印迹检测ASC的泛素化水平，发现USP3显著降低ASC泛素化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
USP3去泛素化并稳定接头蛋白ASC以调节炎症小体活化
USP3 deubiquitinates and stabilizes the adapter protein ASC to regulate inflammasome activation
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、THP-1、RAW264.7、PMs）验证相互作用、去泛素化、稳定性和功能，并采用CRISPR-Cas9敲除、siRNA敲低、回补实验、点突变及多种体内小鼠模型（Alum腹膜炎、F. novicida感染、鞭毛蛋白肺炎）进行验证。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞（PMs） THP-1细胞（人单核细胞系，经PMA分化为巨噬细胞样） HEK293T细胞（用于过表达和泛素化分析） 小鼠模型（C57BL/6 WT小鼠，USP3过表达） RAW264.7巨噬细胞（ASC缺陷）
重点核对
USP3与ASC的相互作用区域（ASC的CARD结构域和USP3的UCH结构域） USP3催化活性位点C168S对去泛素化功能的影响 ASC上K174（人）或K172（鼠）为USP3作用的主要泛素化位点 USP3敲低或敲除后ASC蛋白水平、K48-泛素化水平及IL-1β分泌的变化 USP3过表达在Alum腹膜炎、F. novicida感染和鞭毛蛋白肺炎模型中的体内效应
摘要
炎症小体是先天免疫系统的重要组成部分，是抵御感染的关键，而炎症小体活化的失调对人类健康有不利影响。炎症小体的活化受到严密调控以维持免疫稳态，但其潜在机制仍不清楚。在这里，我们将USP3确定为ASC的直接去泛素化酶（DUB），ASC是介导大多数炎症小体组装和活化的中央接头蛋白。USP3去除ASC上K48连接的泛素化，并通过阻断蛋白酶体降解来增强其稳定性。此外，USP3促进炎症小体活化，这一功能在体内铝（Alum）诱导的腹膜炎、土拉弗朗西斯菌（F. novicida）感染和鞭毛蛋白诱导的肺炎小鼠模型中得到证实。我们的工作揭示了USP3作为ASC泛素化的关键调节因子，维持ASC介导炎症小体活化的生理作用，并提出了ASC泛素化调节炎症小体活化的新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASC作为多种炎症小体的中央接头蛋白，其去泛素化酶（DUB）尚未明确，本研究旨在鉴定ASC的DUB并探究其调控炎症小体活化的机制。
- 核心机制
- USP3通过其UCH结构域与ASC的CARD结构域直接相互作用，去除ASC上K174（人K174，鼠K172）位点的K48连接泛素化链，从而阻断ASC的蛋白酶体降解，稳定ASC蛋白，进而促进ASC斑点形成、寡聚化及下游炎症小体活化。
- 主要证据
- 通过Co-IP、体外去泛素化实验、泛素化突变体分析证明USP3直接去泛素化ASC；在PMs、THP-1和RAW264.7细胞中敲低或敲除USP3减少ASC蛋白、增加K48-泛素化并抑制IL-1β分泌；体内过表达USP3增强Alum诱导的腹膜炎、F. novicida感染和flagellin诱导的肺炎中的IL-1β产生和炎症细胞浸润。
- 研究意义
- 首次揭示USP3作为ASC的K48连接泛素化的直接调节因子，为理解ASC泛素化在炎症小体活化中的调控机制提供了新视角，并可能为炎症性疾病治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP3与ASC的直接相互作用
确认USP3与ASC是否直接结合，并确定结合结构域。
通过免疫共沉淀（Co-IP）检测外源及内源USP3与ASC的相互作用；体外pulldown用重组蛋白验证直接结合；共聚焦显微镜观察共定位；构建ASC和USP3的截短突变体确定结合结构域。
检测USP3对ASC泛素化的影响
确定USP3去除ASC泛素化的类型和位点，并验证其催化活性依赖性。
体外去泛素化实验：纯化泛素化ASC与重组USP3共孵育；细胞内实验：共转染ASC、泛素突变体（K48、K63、K48R）及USP3或催化突变体C168S，检测ASC泛素化变化；构建ASC CARD区域赖氨酸突变体，确定USP3作用位点；在PMs和THP-1细胞中敲低或敲除USP3，检测内源ASC泛素化。
分析USP3对ASC蛋白稳定性的影响
验证USP3通过去泛素化抑制ASC的蛋白酶体降解，从而增强其稳定性。
在HEK293T细胞中共转染ASC和K48-Ub及不同量USP3，检测ASC蛋白水平；在THP-1细胞中敲除USP3，用CHX追踪ASC降解，并用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂3-MA、氯喹处理，确定降解途径。
验证USP3对ASC斑点形成和寡聚化的影响
探究USP3是否影响ASC聚集和寡聚化，进而影响炎症小体组装。
通过免疫荧光染色检测ASC斑点（specks）形成；使用DSS交联ASC，检测单体和寡聚体水平。
体外验证USP3对炎症小体活化的功能
确定USP3在细胞内对炎症小体活化的促进作用及特异性。
在PMs中敲低Usp3，或在THP-1中敲除USP3，用LPS加不同NLRP3激活剂（ATP、尼日利亚霉素、Alum）或其他炎症小体激活剂（poly(dA:dT)、鞭毛蛋白、C3毒素）处理，检测IL-1β、TNF-α、IL-6分泌、caspase-1裂解和LDH释放；在RAW264.7中回补ASC或ASC-K172R，检测IL-1β分泌。
体内验证USP3过表达对炎症小体活化的影响
在动物模型中验证USP3对NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体活化的促进作用。
通过尾静脉注射质粒在小鼠中过表达USP3，然后建立Alum诱导的腹膜炎模型、F. novicida感染模型和鞭毛蛋白诱导的肺炎模型，检测IL-1β分泌、细胞因子水平、细菌载量和炎症细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与敲低
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma Aldrich | P1585 |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尼日利亚霉素 | Invitrogen | -- | |
| 铝佐剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 鞭毛蛋白 | Invitrogen | -- | |
| poly (dA:dT) | Invitrogen | -- | |
| C3毒素 | Cytoskeleton | -- | |
| 蛋白降解抑制 | MG132 | Sigma-Aldrich | -- |
| 3-甲基腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2亲和珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- |
| ECL western印迹检测试剂 | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | 蔡司LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 体内转染 | Entranster-in vivo体内转染试剂 | Engreen | -- |
| RNA提取 | RNA Fast 200试剂盒 | Fastagen | -- |
| 反转录 | 逆转录酶 | Takara Bio | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR预混液 | Roche Diagnostics | -- |
| CFX-Connect检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech | -- | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech | -- | |
| 转染 | Lipofectamine RNAi-MAX | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组化 | DAPI | Abcam | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 568羊抗鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11004 |
| Alexa Fluor 488羊抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | |
| 流式细胞术 | 7AAD | BioLegend | 559925 |
| 抗Ly6G抗体 | BioLegend | 127605 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 17-0012-81 | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128007 | |
| 免疫印迹 | 抗USP3抗体 | Proteintech | 12490-1-AP |
| 抗ASC抗体 | Cell Signaling Technology | 67824 | |
| 抗ASC抗体 | Cell Signaling Technology | 13833 | |
| 抗K48-泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081 | |
| 抗K63-泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 12930 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12242 | |
| 抗IL-1β p17抗体 | Cell Signaling Technology | 85658 | |
| 抗IκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 4812 | |
| 抗磷酸化IκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 4377 | |
| 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 抗IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 8943 | |
| 抗磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2078 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗c-Myc抗体（小鼠单克隆） | OriGene | TA150121-1 | |
| 抗c-Myc抗体（兔多克隆） | Bethl Laboratories | A190-105A | |
| 抗Flag抗体 | Abmart | M20008 | |
| 抗HA抗体 | Rockland Immunochemicals | -- | |
| 抗泛素（P4D1）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗caspase-1抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| 抗NLRP3抗体 | AdipoGen | AG-20B-0014-C100 | |
| 抗β-actin抗体 | Beijing Zhongshan Jin-qiao Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | 细胞系来源、培养基（RPMI-1640或DMEM）、血清浓度、青霉素-链霉素浓度、PMA分化浓度和时间 阅读提示：Methods: Mice and cells |
| 炎症小体活化 | LPS浓度、ATP浓度、Nigericin浓度、Alum浓度、刺激时间 阅读提示：Methods: Reagents and antibodies; Figure legends 5A-F |
| 基因敲低或敲除 | siRNA序列、转染试剂、CRISPR-Cas9靶点序列、筛选方法 阅读提示：Methods: Plasmid constructs and small interfering RNA; Generation of USP3-KO THP-1 cells |
| 蛋白相互作用 | 裂解液成分、抗体、免疫沉淀条件、洗涤次数 阅读提示：Methods: Coimmunoprecipitation assay; Figure legend 1 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、质粒注射剂量和方法、Alum剂量、F. novicida感染剂量和途径、flagellin剂量和途径 阅读提示：Methods: In vivo transfection; In vivo Alum-induced peritonitis; F. novicida infection of mice; In vivo flagellin-induced pneumonia; Figure legends 6B-H |