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面-肩-肱骨营养不良 1 型 (FSHD1，OMIM https:// www.omim.org/entry/158900) 是一种常染色体显性遗传的肌营养不良疾病，具有进行性和局部骨骼肌受累，疾病外显率可变等特点[1,2] 。FSHD1 的致病遗传机制是编码 DUX4 基因的表观遗传去抑制引起的，该编码基因位于 4q 染色体亚端粒区 D4Z4 位点的卫星串联重复序列中。未受影响的个体在 D4Z4 位点携带 11-100 个高度相似、长约 3.3kb 的 KpnI 重复序列，每个重复序列包含 1 个编码转录调控因子 DUX4 基因的开放阅读框，该基因通常在胚胎发育过程中表达，在体细胞组织中被表观遗传修饰抑制。受影响的个体携带 1 到 10 个 KpnI 重复序列的等位基因和一组在邻近的 pLAM 序列中包含一个多聚腺苷化信号的 4qA 易感单倍型，这种基因组合导致 DUX4 的异常表达，引发骨骼肌细胞损害效应[1,3,4] 。 FSHD1 的分子诊断通常是通过 Southern Blotting 实现，但该方法需要大量的 DNA 样本，且有高达 23% 的病例结果并不确定，这些因素也催生出一些新的检测方法[5,6]。

原发灶不明肿瘤 (Cancer of Unknown Primary, CUP) 是一类特殊且复杂的恶性肿瘤。CUP 患者在确诊时已出现远端转移，但却无法确定其原发部位。CUP 患者约占所有癌症确诊患者的 2% [1-2]，且预后通常较差，五年生存率不足 20%。 目前，CUP 的诊断主要依赖于形态学和免疫组化方法[3]，但这些方法在区分不同类型癌症方面存在很大局限。随着基因组学和表观基因组学的发展，研究人员发现 DNA 甲基化模式在不同组织和癌症类型之间存在显著差异[4]。DNA 甲基化是一种重要的可以调控基因表达的表观遗传修饰，这种修饰在癌症中经常发生改变。因此，可以通过分析特定的 CpG 位点的 DNA 甲基化模式实现 CUP 患者原发部位的精确识别，进而为个性化治疗提供依据。

非小细胞肺癌 (NSCLC) 是最常见的肺癌类型，占肺癌总病种的 85%[1]。遗憾的是，70% 的患者在初诊时已是晚期[2-3]，传统的化疗和放疗效果有限。近些年来，以重新激活癌症患者弱化的免疫细胞为目的的免疫疗法已经取得了明显可见的成效[4]，其中尤为值得注意的是免疫检查点抑制剂 (ICIs)。例如，程序性细胞死亡蛋白-1 (programmed death-1，PD-1) 及其配体 (PD-L1) 抑制剂通过阻断 PD-1/PD-L1 结合恢复效应 T 细胞活性和抗肿瘤免疫反应，从而增加抗肿瘤作用[5]。在一线 PD-1/PD-L1 抑制剂联合化疗组中,总体客观缓解率 (objective response rate，ORR) 为 50%，二线单药治疗的 ORR 约为 15%-20%[6]。然而，由于继发性耐药，疾病进展 (progressive disease，PD) 通常在 1 年内出现[7]，后续治疗选择有限。西达本胺 (Chidamide) 作为一种口服的亚型选择性组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂，靶向调控血液系统肿瘤以及乳腺癌等实体瘤存在的表观遗传异常[8]，用于复发或难治性外周 T 细胞淋巴瘤及某些乳腺癌的治疗[9-10]，实现了从血液恶性肿瘤到实体肿瘤的跨越，为耐药 NSCLC 患者带来了新的希望和选择。

结直肠癌 (Colorectal Cancer, CRC) 是全球范围内癌症相关死亡的第三大原因，每年新发病例超过 185 万，死亡病例达 85 万[1]。CRC 的高死亡率和预后不良主要与转移和药物耐药性有关[2]。25% 的 CRC 患者在初次诊断时即表现出转移，而 50% 的患者在病程中会出现转移。尽管临床上使用了多种药物，但药物耐药性仍然是 CRC 治疗中的重要障碍[3-4]。表观遗传变化与耐药性相关，可能在疾病的转移进展中起重要作用。MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，通过与靶 mRNA 结合，主要参与转录后基因表达调控。它们在细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤的生长转移等多种生物过程中发挥重要作用[5]。因此，研究此“微小操控者”—— miRNA 调控基因在 CRC 中的作用具有重要临床意义。

Illumina 测序的本质是边合成边测序，这种测序原理需要接头 (Adapter) 的存在。接头是一段已知序列的短双链 DNA，是连接测序芯片与待测片段之间的“桥梁”。 Illumina 测序平台最常见接头结构有两种：Truseq 和 Nextera。

无需序列转化，如何实现超灵敏度甲基化与突变共检？

DNA 甲基化是 DNA 上的一种化学共价修饰，在不改变 DNA 序列的前提下，影响 DNA 片段的活性，从而改变遗传表现，是一种高度保守的表观遗传修饰。DNA 甲基化广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中，在调控基因表达、胚胎发育、细胞增殖、细胞分化、维持基因组稳定和抵御外源 DNA 病毒入侵等生物学过程中起到至关重要的作用。 癌细胞中的 DNA 异常甲基化贯穿于癌症发生和发展的全过程。与传统的肿瘤标志物相比，DNA 甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。因此，可以通过甲基化标志物检测辅助癌症早期诊断，评估进展风险，评估肿瘤微小残留病灶 (MRD) 和监测复发，还可作为化疗敏感性的标志，更好地指导治疗方案[1-5]。

近年来，NGS 在临床诊断、科研探索、农业育种和公共卫生监测等多个领域的应用场景不断拓展。然而，NGS 工作流程中的文库制备环节因其复杂性和耗时性，俨然成为制约全流程效率的瓶颈。 随着自动化硬件技术的不断革新和软件算法的持续优化，NGS 领域内的自动化设备和试剂方案也不断推陈出新。华大智造的 MGISP-Smart 8 作为一款全新的国产自动化样本制备系统，凭借其独特的功能和特性，可为实验室的自动化操作提供强有力的支持 (图 1.)。为了更高效地将基因检测产品运用于包括 MGISP-Smart 8 在内的自动化平台，纳昂达结合自身产品特性，已相继开发出多应用场景下的自动化适配整体解决方案，旨在降低 NGS 应用适配于自动化工作站的难度。

在新冠肺炎疫情爆发的三年里，SARS-CoV-2 已严重威胁了全球公共卫生安全，给经济和医疗系统带来了沉重负担。世界卫生组织于 2020 年 6 月成立了病毒进化工作组，特别关注了 SARS-CoV-2 变异株、其表型及其对应对措施的影响。自 SARS-CoV-2 出现以来，科研人员已通过测序的方式从数百万例临床样本发现了数百种 SARS-CoV-2 变异株[1]。因此，对病原体基因组特征的持续追踪显得至关重要，以促进病原体的早期发现、准确监测和变异追踪，并迅速评估 SARS-CoV-2 变异株对公共卫生构成的风险。 目前，基于 NGS 对特定基因组区域进行选择性富集或捕获测序的方式主要分为两种：第一种是基于多重 PCR 扩增子的富集[2]，需要对目标基因组区域进行引物设计，其对于新突变的检测能力较差[3]。第二种是传统液相杂交捕获技术[4]，捕获探针具有一定的容错性，因此能够用来持续追踪新的变异类型；然而，该方法的流程较为繁琐，操作时间长，从核酸提取到文库捕获需要 2-3 天，无法满足突发疫情快速响应的需求。 2024 年 4 月 2 日，南京医科大学公共卫生学院联合国家卫健委相关重点实验室，在 mSystems (IF = 6.4) 期刊上发表了题为“A novel fast hybrid capture sequencing method for high-efficiency common human coronavirus whole-genome acquisition”的研究性论文。该研究团队介绍了一种新颖、快速、高效的全新杂交捕获方法，名为微靶杂交捕获系统 (Micro-target Capture, MT-Capture)，旨在实现病毒全基因组的及时测序。研究人员通过对上百份临床样本进行测试，发现该方法不仅解决了传统杂交捕获测序 (Traditional Capture，T-Capture) 耗时长、操作复杂的痛点问题，还比多重 PCR 扩增子的富集更具兼容性，并且相较于其他两种方法具有更高的灵敏度。MT-Capture 新方法的出现使流行病学干预和公共卫生策略变得更加精准，不仅适用于人类冠状病毒，还可扩展至其他微生物病原体、人类癌症，甚至复杂的环境样本。因此，这种方法可以用来增强监测工作，从而有可能预防或缓解未来的流行病。 其中，靶向富集测序方案中的总 RNA 反转录试剂盒和文库构建以及液相杂交捕获全系列试剂均来自纳昂达 (Nanodigmbio)。纳昂达基于全新 μCaler 杂交捕获技术，为文章中使用的微靶杂交捕获系统 (MT-Capture) 提供了技术支持。

DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在癌症、遗传学、表观遗传学和干细胞研究领域应用广泛[1]。目前，亚硫酸氢盐转化 (Bisulfite conversion, BS) 是 DNA 转化的主流技术之一。通过亚硫酸氢盐处理 DNA，将 DNA 中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转化为尿嘧啶 (U)，之后经 PCR 扩增后进一步变成胸腺嘧啶 (T)，而原本甲基化的 C 保持不变，通过测序后对 DNA 序列的分析区分甲基化状态的不同。然而 BS 转化过程中剧烈的温度和 pH 变化会导致 DNA 降解和断裂，因此更适用于起始量较高的样本。 NGS 可同时进行数百个至全基因组的 DNA 甲基化检测，并结合不同的基因 Panel 进行选择。DNA 甲基化检测的文库构建策略分为“先建库后转化”和“先转化后建库”两种。DNA 单链建库技术可对 BS 转化处理后的单链及损伤 DNA 最大程度的利用和转化，从而提供完整性更高、偏好性更低的甲基化文库，尤其是低起始投入量样本。 在上篇文章中，我们已经了解了单链建库对双低样本的稳定建库情况，本期就跟着小编一起看看单链建库技术为我们提供的高精度甲基化建库解决方案吧~

免疫检查点阻断 (Immune checkpoint blockade, ICB) 为改善食管鳞状细胞癌 (Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC) 患者的生存提供了新的策略，其原理是通过阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，从而来解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。有研究表明，抗 PD-1 单克隆抗体与铂类化疗的组合疗法相较于单独化疗表现出更优越的疗效。多项研究尝试评估化疗联合免疫治疗在可切除 ESCC 患者中的可行性和有效性。 然而，PD-L1 表达无法解释 ESCC 患者对免疫治疗效果的差异性，肿瘤突变负荷 (Tumor Mutational Burden, TMB) 的预测效果也存在较大争议。ESCC 新辅助化学免疫治疗效果的细胞和分子机制仍不清楚，这阻碍了免疫检查点阻断治疗受益人群的进一步扩大。 2024 年 1 月 19 日，复旦大学附属中山医院和复旦大学生物医学研究院葛棣、古杰和刘荣花团队在 eBioMedicine (IF=11.1) 期刊上发表了题为 “Genomic profiling and associated B cell lineages delineate the efficacy of neoadjuvant anti-PD-1-based therapy in oesophageal squamous cell carcinoma” 的研究论文。研究团队通过整合 24 例接受 PD-1 抑制剂联合紫杉醇和铂类化疗新辅助治疗的 ESCC 患者样本的全外显子组测序 (Whole-exome sequencing, WES)、单细胞 RNA 测序和免疫荧光数据，以揭示影响 ESCC 新辅助治疗效果的决定性因素。其中 WES 测序方案的文库构建和靶向捕获试剂，包括全外显子捕获 Panel (NEXome Plus Panel v1.0)，全部来自纳昂达 (Nanodigmbio)。

ssDNA 通用型文库制备方案 (for Illumina®) 基于高效的单链连接原理，专为 Illumina® 高通量测序平台而开发。该方案特别适用于低质量样本和微量样本的文库构建，起始量可从 10 pg 到 250 ng，适用于全基因组测序、全基因组甲基化测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。经过优化设计，该方案可兼容 cfDNA、gDNA、FFPE DNA，及其亚硫酸氢盐转化后的产物。

抗生素的过度使用会导致耐药菌株数量增加，从而严重影响公众健康。但是对耐药性进行正确评估通常很难进行，这是由于抗菌敏感性测试 (AST) 需要先分离培养物中的细菌病原体，这一过程可能需要持续数天且丰度较低。与此同时，在缺乏确定的微生物耐药诊断的情况下，临床治疗用药又依赖于经验。这会导致更广泛的抗生素过度使用，加剧临床耐药的困境。 为了控制抗生素滥用和快速指导病原体感染正确合理用药，高效准确的临床检测手段显得愈发重要。mNGS 和 tNGS 能在一次测序中同时测定许多病原体的基因序列，包括细菌、病毒、真菌等在内的整个微生物群落的基因组构成，有助于快速确定致病微生物及相关耐药基因，非常有望能落实在包括呼吸道感染在内的临床实践中。mNGS 检测方法难以排除人源基因背景，尤其是在呼吸道和其他临床体液中，病原体耐药和毒力基因的丰度本身较低，使得 mNGS 的耐药灵敏度检测受限并且成本高昂。tNGS 可针对低丰度序列靶向富集，由此识别病原体和相关耐药基因，灵敏度更高[1-4]。 纳昂达推出的 tNGS 靶向捕获方案：NEX-t Panel v1.0，既能用于鉴定病毒、细菌、真菌、寄生虫等数百种病原，也适用于相应的耐药和毒力分析（新品上线 | NEX-t Panel：更精准、更经济的 tNGS 病原检测方案）。在本文中，我们将重点展示 NEX-t 应用于病原微生物耐药基因和毒力基因检测的结果，并与 mNGS 的结果进行对比分析。

在 2023 年 11 月，纳昂达推出了全球首创的 μCaler® 甲基化杂交捕获富集系统 (新品上线 | μCaler® 甲基化检测助力实现多癌种早筛新突破 (上)；新品上线 | μCaler® 甲基化检测助力实现多癌种早筛新突破 (下))。该系统采用独有的 μCaler® 专利杂交捕获技术，为用户提供了精准、稳定、高效、快速且简单的甲基化测序新体验；不仅提升了甲基化检测的效率和准确性，更为多癌种早期筛查提供了新的突破。

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DNA 文库构建是高通量测序 (Next Generation Sequencing, NGS) 技术的基础，其过程是将待测样本的大片段基因组 DNA 通过超声或酶切打断为小片段 DNA，然后在小片段 DNA 分子两端连接特定的测序接头，形成符合测序平台要求的有效文库。常规的 NGS 实验全流程包括核酸提取、文库构建、靶向捕获、上机测序及数据分析等环节。其中，文库构建作为 NGS 湿实验流程中的核心环节，对于成功进行 NGS 工作流程至关重要。因此，选用不同的文库构建试剂盒制备的文库质量直接影响着最终测序结果的准确性和可靠性。随着 NGS 技术的不断进步，NGS 已广泛应用于基础研究、遗传病检测、NIPT、肿瘤伴随诊断、胚胎植入前筛查以及感染病原体鉴定等领域，应用端对测序文库的稳定性、有效性、准确性和高效性等提出了更高要求。由此看来，NGS 文库构建流程的便捷性以及转化率 (起始 DNA 成功转化为可测序文库的比例) 的提升显得尤为重要。因此，为满足市场需求，纳昂达推出了升级版文库制备试剂盒：NadPrep® DNA Library Preparation Module v2，可在3 hr 内完成全基因组文库制备。在 v1 版本的基础上，v2 版本提高了低质量样本的文库产量与质量，且提升了文库转化率。此外，NadPrep® DNA Library Preparation Module v2 兼容纳昂达已推出的不同平台和不同类型接头，支持自由选择搭配。

基于液相杂交捕获的靶向测序，通过捕获基因组的特定区域，有助于以更低成本达到更高的测序深度，由此实现更高的检测特异性和灵敏度。然而，传统杂交捕获实验不仅流程耗时长、操作复杂，受人员操作影响较大，而且对较小区域的捕获效率也不高，在一定程度上限制了其在强调时效性和成本敏感的应用场景，如 MRD 检测。 为克服上述局限性，纳昂达推出独家专利的 μCaler® 技术，采用基于“共轭效应”原理的探针设计，使得探针结合更为牢固，特异性更高。这种方法操作流程上也更为简易，2.5 小时内即可完成全部的杂交捕获流程。μCaler® Panel 系列搭配 μCaler® Hybrid Capture Reagents v2 和 μCaler® NanoBlockers 系列构成完整的液相杂交捕获体系，并支持 MGI 和 Illumina 主流测序平台完整的杂交捕获解决方案。

2024 年 01 月 22 日，复旦大学生殖与发育研究院黄荷凤院士携复旦大学和浙江大学等单位的研究人员在国际顶刊 Nature Medicine (IF = 82.9) 发表了题为 “Prospective prenatal cell-free DNA screening for genetic conditions of heterogenous etiologies” 的最新临床研究结果。这项前瞻性、多中心的观察性研究，采用创新性的综合性无创产前筛查技术 (cfDNA 综合筛查)，共计纳入 1,090 名高风险孕妇。cfDNA 综合筛查技术检测敏感性达 98.5%，特异性为 99.3%。并且相比于传统的只包括染色体疾病的 NIPT 筛查，提高对致病性遗传变异的检出率达到 60.7%；验证了其在产前同时筛查胎儿染色体病、微缺失微重复综合征和单基因病的临床有效性。其中测序方案的 cfDNA 文库构建试剂全部来自纳昂达 (Nanodigmbio)。

NadAuto-16R 全自动 NGS 工作站的推出源于对 NGS 全流程湿实验的深刻理解和对实验操作挑战的洞察，是纳昂达专为 NGS 领域研发设计的一款全自动工作站，旨在提供更高效、更精准的实验工具，满足市场对高通量、高质量实验的需求。 NadAuto-16R 全自动 NGS 工作站的推出不仅提高了实验操作的标准化水平，而且提升了实验流程的工作效率，同时显著减少了人为操作引入的误差。NadAuto-16R 致力于为科研人员提供一种更智能、更可靠的实验解决方案，助力他们在 NGS 领域取得更为显著的成就。

RNA & DNA 双流程检测成本高，亟需 RNA & DNA 单管共建库方案以降低检测成本，缩短检测时间。结合病原微生物靶向测序 (tNGS)，更好地助力临床感染快速精准诊疗。