EMSA 实验操作
1、细胞核蛋白提取：
（1）弃培养液上清，每孔加1 ml冷PBS重悬浮细胞，移至1.5 ml EP管内，4000 rpm，离心8 min，去上清，冷PBS洗2遍，离心，去上清。
（2）加200μl低渗缓冲液（Buffer A）悬浮细胞。
低渗缓冲液配方：10 mM Hepes（pH 7.9），15 mM KCl，1 mM MgCl2，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，1 mM DTT，0.5 mM PMSF。DTT、PMSF均配成100 mM溶液，实验时每200 μl Buffer A加2 μl DTT、1 μl PMSF。
（3）冰上15 min，细胞肿胀，加入12.5μl 10% Nonidet P-40, 剧烈振荡10 sec，破细胞膜。
（4）离心，9000 rpm，30 sec（时间要准确）。
（5）弃上清，加50 μl高渗缓冲液（Buffer B）悬浮沉淀。
高渗缓冲液配方：20 mM Hepes pH 7.9，1.5 mM MgCl2，0.42 M NaCl，0.2 mM EDTA，25 %甘油，1 mM DTT，1 mM PMSF。DTT、PMSF均配成100 mM溶液，实验时每50 μl Buffer B加0.5 μl DTT、0.5 μl PMSF。
（6）冰上30 sec，反复吹打，破细胞核膜。
（7）4℃，12500×g，10 min。
（8）取上清分装。先取5μl置1.5 ml EP管中，-20℃冻存，用于定量。其余的10μl/管分装于PCR管或EP管中，-70℃冻存待用。
2、核蛋白定量：Brodford法, 略有改进。
（1）考马斯亮兰G-250溶液配制：称量15 mg考马斯亮兰溶于5 ml 95%乙醇中，加10 ml 85%磷酸，补加ddH2O至100 ml，粗滤纸过滤，4℃储存备用（不超过3周）。
（2）标准蛋白配制：称量100 mg牛血清白蛋白粉末，溶于100 ml ddH2O中，轻轻摇匀，终浓度为1 mg/ml。
（3）制作标准曲线及核蛋白定量：取8个1.5 ml EP管，将标准蛋白用ddH2O倍比稀释，分别为：1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.016 mg/ml，每管50μl，另用50μl ddH2O作空白对照。分别取样品5μl，加45μl双蒸水（即作10倍稀释）。所有EP管内加入500μl考马斯亮兰液，混匀，静置5分钟。按每孔150μl加样于96孔板中，每个样本设三复孔。在酶标仪595 nm单波长处测量标准蛋白及样品的吸光值。求回归方程Y=a+bX，并计算出样本蛋白含量。
3、寡核苷酸探针的标记。
以下步骤参照《分子克隆实验指南》，加以改进。
（1）人NF-κB保守序列探针：由上海博亚公司合成。
序列：a链：5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'
b链：3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5'
（2）将a、b两条链（每管1 OD，5 nmol）分别用500μl ddH2O稀释成10 pmol/μl。取2支1.5 ml EP管，分别加入：
T4 多核苷酸激酶（10 U/μl） 1μl
10×T4激酶缓冲液 2μl
未标记寡核苷酸（a、b链各1管） 1μl
[γ-32P] ATP 5μl
ddH2O 11μl
共计 20μl
（3）将上述加好样的EP管充分混匀，置37℃孵育1.5～2小时。
（4）将a链和b链两管合为1管，置68℃ 10 min，以灭活T4激酶。
（5）37℃孵育1小时，使a、b链结合成双链。-20℃保存。
4、标记探针的纯化
（1）冰箱取出标记好的双链探针（约40μl），加100μl预冷无水乙醇，10μl预冷乙酸铵（5 M），混匀，-20℃静置30 min。
（2）4℃，13000×g，离心15 min，弃上清。
（3）200μl预冷乙酸铵（1M）重悬沉淀，再加400μl预冷无水乙醇，混匀，置-20℃ 30 min。
（4）4℃，13000×g，离心15 min，弃上清，自然晾干沉淀。
（5）用100μl TE溶液溶解沉淀，溶解后探针浓度约为1 ng/μl。-20℃保存备用。
5、标记探针比活性测试
（1）将纤维素滤膜剪成直径约1 cm的圆片状， 取1μl标记探针，点样于纤维素滤膜的正面，晾干。
（2）用100 ml 0.5 mol/L Na2HPO4（pH7.0）漂洗膜片3次。
（3）将漂洗的膜片转移到装有100 ml 70%乙醇的烧杯中放置片刻，于室温下晾干。
（4）送核医学科使用液体闪烁计数仪测定该1μl探针所具有的放射性强度。（进行NF-κB/DNA结合反应时，要求探针的放射性强度为20000 cpm左右。）
6、NF-κB与DNA结合反应
（1）DNA结合Buffer配制：
1 mol/L Tris-HCl （pH8.0） 10μl
1 mol/L NaCl 50μl
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 1μl
1 mol/L DTT 1μl
1 mol/L MgCl2 1μl
甘油 40μl
1μg/μl Poly [dI/dc] 100μl
补加ddH2O至总体积 1000μl
（2）结合反应。取一支1.5 ml EP管，加入5μg核蛋白、17μl DNA结合Buffer、1μl标记探针，混匀，室温或37℃结合30分钟。
7、电泳
（1）5×TBE配制：Tris 54 g，硼酸27.5 g，0.5 M EDTA（pH8.0）20 ml，加ddH2O 600ml，溶解后，补充ddH2O至总体积1000 ml。
（2）6×上样Buffer配制：溴酚蓝0.025 g，二甲苯青FF 0.025 g，甘油3 ml，加入适量ddH2O溶解，补加ddH2O至总体积10 ml。分装，置4℃保存。
（3）安装好蛋白电泳槽。
（4）制备5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：在100 ml烧杯内，先后加入ddH2O 12.54 ml，5×TBE 4ml，30%聚丙烯酰胺3.32 ml，10%过硫酸铵0.14 ml，TEMED 15μl，迅速混匀，灌入两层玻璃板间隙，插上梳子，置37℃加速聚合。
（5）待凝胶完全聚合后，电泳槽内加入0.25×TBE电泳缓冲液，小心拔出梳子，用电泳缓冲液小心冲洗梳孔，不得留有气泡。
（6）在每个结合反应后的样本EP管内（约20μl）加4μl上样Buffer，混匀，微量注射器逐一加样。
（7）15~18 mA恒流电泳40~60分钟。
8、放射自显影
（1）待溴酚蓝指示剂已电泳约3/4时，停止电泳，取胶。
（2）用保鲜膜封住胶，暗室装X光片，-70℃放射自显影48 h。
（3）暗室取出X光片，显影1～2分钟，用清水漂洗去除显影剂，然后定影约5～10分钟，清水冲洗干净，自然晾干。
（4）扫描图象，存盘。
