miRNA shRNA设计原则
一、RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。其中shRNA设计在慢病毒的构建上应用颇广，本文对shRNA设计原则和操作技巧进行介绍。
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3.StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。
5.shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。
6.shRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(Ambion use)。
7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。
8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。
9.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。
英杰公司总结的siRNA 和shRNA成功必知：在使用Stealth™ RNA前优化转染条件，在每次实验中都实验BLOCK-iT™RNAi系列产品，应用RT-PCR进行实验结果分析，知道你想抑制的蛋白质半衰期，始终包含适当的阳性和阴性对照，按照标准准则使用Stealth™ RNA对siRNA进行分析。
1.从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
2. 有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
3.寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点，将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
4.避免序列中连续出现4个及以上T或A，以为它们会被Polymerase III，认为是转录终止子。
二、实验安排：
a.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
b.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。
