RNA pull down 问题与解答
问题1：RNA结合蛋白没有结合
可能原因：
1)靶蛋白量不足
2)缓冲体系不对
3)RNA探针和蛋白的亲和力本来就低
解决办法：
1)增加上样蛋白量
2)应用低盐体系
3)加入交联试剂
问题1：RNA 降解
可能原因：
无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。
解决办法：
清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度
问题2：RNA结合蛋白的亲和力不够：
可能原因：
结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。
解决办法：
优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等
问题3：结合的非特异性高
可能原因：
1)缓冲环境没有优化
2)缓冲环境严谨性低
3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化
解决方法：
1)优化孵育时间温度盐浓度等条件
2)使用严谨性高的缓冲体系
3)调低RNA探针和样品的比例
4)提高裂解液的量
问题4：WB信噪比高
可能原因：
1)阳性信号率低
2)一抗效率低
3)蛋白没有充分溶解
解决方法：
1)增加二抗的量
2)用敏感度的化学发光液
3)用细胞裂解液预孵一抗
4)增加样品的量
5)确定有没有其他可能的结合情况
6)增加裂解液用量
