miRNA 靶基因筛选及验证
1.荧光素酶报告基因实验
1.1 荧光素酶报告基因质粒的构建
靶基因3’UTR的获得。3’UTR序列是指从Mrnaz终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA最后一个碱基（通常是polyA结尾）。模板可采用相应物种的cDNA或基因组。在选择模板时要注意：一般来讲，cDNA适于所有的3’UTR扩增，但有时3’端AT过多导致引物设计困难时，可以考虑用基因组做模板。但是基因组做模板的前提是靶基因3’UTR由一个外显子组成。相关信息可以从ensembl中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全面的扩增3’UTR，但如果3’UTR过长或引物设计困难，可以选取包括miRNA结合位点的一段3’UTR。
1.2 荧光素报告基因质粒转染
开始做报告基因实验前，你还需要准备以下材料：
1）TK质粒，作为共转染的内参。
2）miRNA的过表达质粒或合成的miRNA。质粒的浓度尽量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀释到20uM。
3）状态良好的细胞。
常用24孔板进行报告基因实验。分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞的方法见细胞培养的方法），每孔细胞数目相当。以293ET细胞为例，我们转染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯转染试剂，细胞密度可以稍高些，因为转染后细胞死亡较多。
转染
转染时必须配总体系再依次分成小体系。这一步决定着每个孔的平行性和实验的可重复性。转染核酸用量为每孔：luc-3’UTR 200ng；TK 50ng；miRNA-pcDNA3.1 1ug或合成的miRNA 2.5ul（终浓度100nM）。Vig每孔用量为1ul，lip2000为2ul。转染后4-6h换液。如果用vig转染必须及时换液，否则细胞会尸横遍野。注意设立合理的对照，通常用pcDNA3.1（或miRNA NC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的对照。
收细胞
转染24-48h可以收取细胞。用生理盐水或PBS清洗细胞两次，因293细胞极易脱落，建议操作温柔，如果对自己的操作没有自信，可以增大生理盐水量只洗一次。之后吸干生理盐水。每孔加入80ul 1Xpassive buffer（裂解液的量可视细胞数目稍作调整），室温摇20min，如果细胞裂解充分会看到白色粘稠状细胞碎片。如果不马上测，可连同24孔板冻于-80度，测时再取出解冻。-20度可保存一周。4度可保存一天。
1.3 测定荧光素酶活性
使用turner仪器进行双荧光素酶的测量。具体仪器操作方法可学习相关教程或请教师兄师姐。我们使用的试剂盒为promega的双荧光素酶报告系统：bufferII为萤火虫荧光素酶的底物，测量数值为我们的报告基因的活性；S&G buffer 作用是淬灭萤火虫荧光素酶的活性并提供海肾荧光素酶反应的缓冲环境，测定的数值为内参的活性。测定时，取细胞裂解液8ul到96孔板中（专用的96孔板）上机测量。每种底物每孔加30ul。
1.4 结果分析
测定荧光素酶后会返回三个值：萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性及两者的比值。比值将作为最后的分析数据，反映了该孔报告基因的相对活性。通常将对照归一为1，实验组与其相比取相对值。此相对值用于最后作图和统计分析。
