miRNA 表达检测 miRNA-qPCR
1. Poly(A)加尾法
特点：
通用性高：一次逆转
录获得的cDNA可用于多个
目标分子的检测。
经济，方便；
2. Loop反转录法
特点：
优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏；
缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测；
引物设计
miRNA realtime-PCR引物设计方法：
1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT
2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。
3.内参基因
人的内参基因选择U6，also as know RNU6A，RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
引物为：
•U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
•U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
该对引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用！
