PAR CLIP 概述
PAR-CLIP光活性增强的核糖核苷交联和免疫共沉淀
正如我们所知，在真核生物体内，基因的转录调控在基因的表达中起到了十分重要的作用。在这一领域中，染色质免疫共沉淀-高通量测序（CHIP-seq，用来测定与DNA作用的反式作用因子蛋白）越来越受研究人员欢迎。同时，转录后的基因调控在基因表达中同样也起到了相当关键的作用， RNA结合蛋白（RBPs）和小RNA-核糖核蛋白复合物（miRNPs）对真核生物基因表达起到了很重要的作用，这些蛋白跟DNA结合蛋白一样，可以与相关的序列结合来指导它们的表达。这些RBPs和miRNPs共同来调控细胞内许多过程，包括mRNA的成熟、运输、修饰和翻译。因此，确定RBPs和miRNPs与它们目标转录本的相互作用在理解真核生物内转录调控的网络是很重要的。
RIP-Clip是一种主要用于分离和鉴定细胞中核糖核蛋白复合体中的mRNAs、microRNAs以及蛋白复合物的方法。这个方法可以确定某些RBP是否能与特定的RNA结合并讲RBPs与其结合的RNA免疫沉淀下来。然而，这个方法并没有给出足够的证据来表明特定的识别序列或者结合的基序。接下来，交联-免疫沉淀法（CLIP）在免疫以前被用来构成RNA-RBP复合物，弥补了RIP-RBP的一些缺点。上述的这两个方法，简单地说，介绍了一般的过程：结合RPBs或者miRNPs的RNAs被分离，然后逆转录，以及做cDNA的测序。但是，CLIP是有局限的，由于UV交联的低效率，这是因为非交联的RNA分子更加容易被逆转录，结果导致高的噪声比和很难分辨出交联与非交联的靶RNAs。目前，一个被改良的技术，结合高通量的测序，被由研究人员建立起来了，那就是PAR-CLIP。
在活体细胞中，紫外光可以将RNA与RNA结合蛋白共价结合起来。在PAR-CLIP方法中，活体细胞被暴露在紫外灯下，使得RNA-蛋白结合起来并且可以用免疫共沉淀的方法使特异性的蛋白以及与其结合RNA一同被分离出来。这个方法中最重要的一点就是方依赖了具有光活性的核糖核苷类似物，例如4-硫尿核苷，在活体细胞中将其插入到新生RNA转录本中。在356nm紫外灯辐射的细胞中，光活性的核糖核标记的RNA被诱导与RBP相互作用。免疫共沉淀所要的RBP，然后分离被交联和共沉淀的RNA。RNA随即被转换成cDNA文库并且使用Solexa技术进行深入测序。通过PAR-CLIP所准备的cDNA文库具有的一个特点就是能够准确的定位交联的位置，而这是依靠cDNA序列的突变位置。当使用4-硫尿核苷时，交联的序列将会产生T-C的转变。这种在被测序的cDNA序列中的转变提供了一个巧妙的解决准确绘制RNA结合蛋白的结合位点方法，从而从噪声中获得了真实的交联的RNA序列。
目前有研究报道下一代高通量体外RNA交联的应用。在他们的方法中，找到了目前多个研究很热门RBPs和miRNPs的结合位点和调控的结果，包括了PUM2、QKI、IGF2BP1-3、AGO/EIF2C-4以及TNC6A-C。他们的研究揭示了一个转录本通常被多个RBPs结合和调控，这种结合将最终决定了基因特异性。RNA与结合蛋白相互作用的位点的准确定位将对分析快速涌现的关于个体间出现的遗传变异方面的数据起到极大的作用，而这其中的一些变异是否能通过影响转录后基因调控来促成复杂的遗传疾病，还有待进一步的探究。
