DNA pull down 实验技术
1．探针设计及标记
① 采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
② 将其克隆至pMD-18T克隆载体，并测序鉴定成功；
③ 使用PCR法或末端标记法标记探针；
④ 标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
⑤ -20℃保存，待用；
2．Pull down
① 预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
② 取 100µl Streptavidin-agaroseG 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
③ 将 DNA 与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子；
④ 4℃孵育 1 小时；
⑤ 5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
⑥ 用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
⑦ 加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
3．蛋白质检测-- western blot
① 电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
② 转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
③ 封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
④ 孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
⑤ 孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
⑥ 显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
4．蛋白质检测-- MS
① 切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
② 清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
③ 脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
④ 脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
⑤ 清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
⑥ 脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
⑦ 用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
⑧ 质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
⑨ 离子源加速电压1为24kv；
⑩ 加速电压2为22kv；
11 离子延迟提取0.000ns；
12 真空度1.4×10-7 Torr；
13 质谱信号单次扫描累加200次；
14 使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
15 样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
16 利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
