ChIP 对照设置
ChIP对照设置
1.input:样本经过超声,但是没有进行ChIP,包含样本超声后总DNA,可以进行电泳,检测超声效果,同时,可以与最后ChIP样本进行比较,看ChIP的效率(如果用同一引物进行PCR,ChIP组和input组亮度差不多,说明ChIP效率高,基本上,样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了,反之,说明效率低,实验条件有待改进)
2、阳性对照:一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因(当然是在该细胞中表达的基因,所以为了保证阳性对照有效,一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的)的核心启动子区,因此,理论上ChIP后PCR都会有条带
3、阴性对照:用普通的IgG做为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阳性对照,但是由于非特异结合,或者实验过程中,没发生结合的DNA清除不完全,可能也会出现条带,最理想的结果当然是没有条带,但是如果有一条淡淡的条带(与阳性对照和目的基因组相比),也是不妨碍的。
4、实验组,就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因引物设计:
(1)ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况,因此引物设计要选择目的基因启动子区,ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段(或者为了保险些选在2000bp),因为一般情况下,转录因子结合在这个区域,当然也有结合在更上游,或者有的文献报道在转录起始位点下游也有结合,我们就不能一一考虑这些有点特殊的情况了,一般实验的时候选择的是转录起始位点上游2000bp的片段。
(2)引物设计原则跟普通的引物相同,但是,超声后DNA被打断,所以PCR产物要尽量短一些,100多bp就足够了,因为产物长度越长,这段DNA被打断的可能性就越大,P出来的可能性就越小
结合位点分组 Ch-IP分组:
结合位点分组 | Ch-IP分组 |
阳性对照组 | input对照组 |
output实验组 | |
NIS/mock对照组 | |
阴性对照组 | input对照组 |
output实验组 | |
NIS/mock对照组 | |
基因位点(1~3) | input对照组 |
output实验组 | |
NIS/mock对照组 |