Spectronaut 带你玩转快速定量蛋白质组学

核糖体作为蛋白质的「合成工厂」，过去的研究一直认为核糖体对 mRNA 没有任何特异性，能合成所有的蛋白质。但 2011 年，斯坦福大学的分子和发育生物学家 Maria Barna 团队发表在《Cell》的文章发现当小鼠体内的某一种核糖体蛋白质欠缺时，其发育会出现很多缺陷，该模型表明核糖体蛋白的缺失会干扰其产生与胚胎发育相关的特定蛋白质。

5 年后，MariaBarna 团队再次在《Cell》上揭示了这一重要发现，他们借助质谱分析 15 种核糖体蛋白时，发现其中只有 9 种是核糖体共有的，30-40% 的核糖体缺少另外 4 种蛋白质，在随后对其余 76 种核糖体蛋白进行大规模质谱分析时，有 7 种蛋白质的差异性能够证明这一观点。

今天我们就来看看蛋白质谱的发展：

蛋白质谱技术是定量蛋白质组学中最新的一项技术，它是通过蛋白酶将蛋白质酶切消化后形成肽段混合物，在质谱仪中将其电离形成带点离子，并通过特定的质荷比（m/z），进而形成一级和二级质谱，从而定量和鉴定蛋白。传统的鸟枪法（DDA，data dependent acquisition）是蛋白质组学里运用最广泛的技术，并且其深度已经超越了 2D 凝胶技术，在 2014 年出版的 Nature 中，超过 15,000 种蛋白质的数据由慕尼黑技术大学的 Kuester 教授组合提供，结合了数百个实验（https://www.proteomicsdb.org）。在单次注射中，通常每个实验可以定期鉴定 3000-4500 个蛋白质。但是鸟枪法仍要有着许多的局限性，它选取高丰度肽段中鉴定，而丢失其他肽段，导致其结果随机性高，重现性低。由蛋白组学先驱 RuediAebersold 教授创立的 Biognosys 公司，经过多年的实验和研究，发明了下一代（nextgeneration）蛋白组学方法，DIA（data-independent acquisition），也被称为 SWATH，成功的解决了这个局限性。

DIA 方法与 DDA 方法比较图

通过 Bruderer 团队发表的 DIA 与 DDA 的重复性比较，再相同的细胞裂解物样品交替进行 24 次分析，DDA 上得到许多数据缺失，是由于其随机和不完全采集模式的结果，而 DIA 上的数据基本上完成。相比于 DDA,DIA 拥有更高的灵敏度和重复性，以及更低的 CV 值，被认为以后可以取代 DDA，更好的实现大规模分析。

处理蛋白质组学产生的巨大数据库，对分析这样的数据是一个巨大的挑战。标准的 HRM/DIA 在 Spectronaut（Biognosys）软件中的流程为，

①向准备好的样本中加入 iRT/HRM 试剂

②利用 Proteome Discoverer™，MaxQuant，ProteinPilot™, Mascot 激发谱库（general spectral library）

③在通过谱库来作为分析中的模板在软件中来识别不同的肽，这使得蛋白定量能够达到最大的分析深度和最高数量的鉴定。

HRM/DIA 工作流程图

Biognosys 从未停下快速蛋白质组学定量技术发展的脚步，就在刚刚过去的 2017 年 6 月，Biognosys 与 Thermo Fisher 达成战略合作协议，其领先的 DIA 技术，将直接让 Spectronaut Pulsar 与 Thermo Scientific Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole Orbitrap mass 兼容。Biognosys 新发布的 Spectronaut Pulsarsoftware 开启了 DIA 技术的新时代。

新的 directDIATM 工作流程将再也不需要激发 DDA 谱库，在 Spectronaut 的新流程中，将可以直接从 DIAruns 中激发谱库用于接下来的鉴定和分析。来自 Thermo Fisher 的蛋白组学和代谢组学市场总监 Andreas Humber 称「DIA 作为定量蛋白组学库的一部分，其大样本中高深度的分析以及高重复（reproducability）率，非常适合发现蛋白组学（discoveryproteomics），同时也是其他定量技术，如 TMT（Tandem Mass Tags），PRM（Parallel Reaction Monitoring）很好的补充。Spectronaut Pulsar 软件为处理大样本 DIA 数据和数据库的建立提供了一个有效的方法」。

如果 MariaBarna 团队应用了 biognosys 的技术，也许不需要长达 5 年的分析，就可以更早地向大家揭示这一发现！

参考资料

1）There are millions of protein factories in every cell. Surprise, they’re not all the same
2) Next-generation Proteomics from an Industrial Perspective
3) Having a free lunch: A combined DIA+DDA approach towards spectral library generation

编辑： weicf    来源：丁香园