DNA 甲基化修饰

DNA 甲基化修饰作为一种重要的表观遗传修饰，能通过影响染色质结构、DNA 构想、稳定性以及蛋白质相互作用方式等，起到调控基因表达的作用。与多种肿瘤的发生、发展密切相关。

DNA 甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。这些变化包括 CpG 岛局部的高甲基化和基因组 DNA 低甲基化状态。它是由 DNA 甲基转移酶（DNA methy-transferase，Dnmt）催化，以 3-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体而发生反应。催化反应有 3 类，包括将腺嘌呤转变为 N-甲基腺嘌呤、将胞嘧啶转变为 N-甲基胞嘧啶以及将胞嘧啶转变为 C-甲基胞嘧啶。在原核生物中这 3 种类型均存在，但是在高等真核生物中只存在第 3 种类型，即将胞嘧啶（C）转变为 5-甲基胞嘧啶（5mC）。

如图 1 左所示，在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的 CpG 岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。而在肿瘤细胞中，该区域的 CpG 岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA 修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。

同样，如图 1 右所示，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄生序列 (endoparasitic sequence) 激活，最终也导致肿瘤发生。 

由于 CpG 岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。

随着 DNA 甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。现有方法，绝大部分都是取样于细胞的 DNA，根据研究水平，又将这些方法归为 3 大类，即：基因组甲基化水平 (Methylation Content) 的分析，候选基因甲基化的分析以及基因组层次的 DNA 甲基化模式 (Methylation pattern) 与甲基化谱 (Methylation Profiling) 的分析。

A. 基因组甲基化水平 (Methylation Content) 的分析:

1. 高效液相色谱 ( HPLC) ：HPLC 是一种比较传统的方法，是根据 DNA 或 蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在 动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以 定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故 而能够定量测定基因组整体水平 DNA 甲基化水平。

2. 高效毛细管电泳法 ( HPCE) ：这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水 性等不同而相互分开。用 HPCE 方法处理 DNA 水解产物来确定 5mC 水平，简便，经济且敏感性高。

必须指出，以上方法虽然能够明确检测出目的序列中所有 CpG 位点的甲基化状况，但并不能对甲基化位点进行定位。

B. 候选基因 (Candidate Gene) 甲基化分析:

1 . 甲 基 化 敏 感 性 限 制 性 内 切 酶 - P C R / Southern 法 ( MSRE-PCR/ Southern) ：这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将 DNA 消化为不同大小的片段后，进行 Southern 或 PCR 扩增分离产物， 明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(CCGG) 和 SmaⅠ- Xmal(CCCGGG)。

2. 重亚硫酸盐测序法 (Bisulphite Sequencing) ：该方法首先用重亚硫酸盐使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行 PCR 扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后，对 PCR 产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否 CpG 位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。

3. 甲基化特异性的 PCR (MS-PCR) ：同样，该方法中，DNA 先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的 PCR。其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化 DNA 链，另一对结合处理后的非甲基化 DNA 链。检测 MS-PCR 扩增产物，如果用针对处理后甲基化 DNA 链的引物能扩增出片段，则说明回目录 该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。

C. 基因组范围的 DNA 甲基 化模式 (Methylation pattern) 与 甲 基 化 谱 ( M e t h y l a t i o n Profiling) 分析:

1 . 限 制 性 标 记 基 因 组 扫描 (Restriction Landmark GenomicScanning, RLGS) RLGS 是最早适用于基因组范围 DNA 甲基化分析的方法之一。该方法先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶 NotⅠ消化基因组 DNA，甲基化位点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带，得到 RLGS 图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位。

2 . 甲 基 化 间 区 位 点 扩 增 (ampl ification of intermethylated sites, AIMS) A I M S 是 基 于 任 意 引 物 PCR (Arbitrary Primed PCR) 的一种方法，由于任意引物 PCR 使用寡核苷酸连接子 (linker) 进行连接，不需要依赖任何序列的先验信息。在该方法中，用来进行扩增的模板序列首先通 过甲基化敏感的限制性内切酶进行消化而富集，其特异性由该酶酶切片断一端的特定序列 结合连接子来保证。随后，由内切酶进行第二次消化，再次连接，提纯进行 PCR 扩增，最后电泳，提取目的序列进行测序。

3 . 甲 基 化 C p G 岛 扩 增 (Methy lated CpG-i s land amplification, MCA) M C A 也是基于任意引物 PCR 的方法，该方法使用两种对甲基化具有不同敏感度的限制性内切酶 (如 SmaI 和 XmaI) 先后进行消化，然后对甲基化敏感的限制性酶切片断进行接头 (Adaptor) 连接，行 PCR，那些富含 CpG 的序列就会被选择性的扩增。该方法对甲基化分析和克隆甲基化差异性基因都非常有帮助。

通过以上论述，不难看到检测甲基化的方法不断涌现，一方面说明其研究难度之大，另一方面也说明种种方法都有其局限性，诸如对酶的依赖，PCR 扩增的问题，芯片数据分析的标准化问题等等。 综上所述，各种表观基因组学技术方法使我们可以绘制出诸如 DNA 甲基化以及组蛋白修饰模式的详细图谱，为我们研究甲基化的生物学功能，以及在肿瘤生成中的作用，以致肿瘤预防、诊断、治疗和预后方面提供更多信息。

编辑： weicf    来源：丁香园