大肠杆菌高效表达外源蛋白的策略

大肠杆菌表达系统是发展最早、目前最为成熟的表达系统。因其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等，是基础研究和商业生产重组蛋白的强大工具；但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如重组蛋白不稳定，生物活性低，以包涵体形式表达。外源基因在大肠杆菌中的表达效率受多个因素的影响，在表达前对目的蛋白进行分析和优化，才能实现目的蛋白的高效表达，主要包括如下几个方面：

(1) 表达载体的选择，表达载体启动子的选择很重要，启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平，理想的启动子应该满足：①具有强启动性，能指导高效转录以保证目的蛋白的高产量；②可严谨调控，在一定条件下开始诱导表达，可最大限度降低细菌的代谢负荷和外源蛋白的毒性作用。其他如 SD 序列位置和转录终止子，也会影响转录和翻译效率。

(2) 密码子优化，含有大量稀有密码子的基因在大肠杆菌中表达时，由于大肠杆菌缺乏某几种 tRNA，会降低 mRNA 的翻译效率和稳定性，甚至会造成翻译错误或提前中止。对目的基因进行密码子改造，可以提高 mRNA 的稳定性和翻译效率。

(3) 融合蛋白及分子伴侣，融合蛋白不仅可以作为亲和标签利于下游纯化操作，而且大分子融合蛋白还能增加蛋白的可溶性表达，如谷胱甘肽-S 转移酶 (GST),SUMO 蛋白，麦芽糖结合蛋白（MBP），亲水性强，有助于提高靶蛋白的可溶性和稳定性；共表达分子伴侣可促进重组蛋白的翻译后折叠加工，提高蛋白可溶性和稳定性。大肠杆菌系统中常用的有 GroEL 和 GroES 体系；热休克蛋白 DnaK，DnaJ 和 GrpE 三元体系；Dsb 家族 (二硫键还原酶及异构酶)，能够促进二硫键的形成。

(4) 靶蛋白的定位表达，重组蛋白在大肠杆菌中合成后有 4 种定位, 即胞质、周质空间、内膜或外膜和细胞外基质中。利用信号肽将重组蛋白分泌到细胞周质或胞外培养基中, 细胞周质空间的氧化环境利于二硫键的形成和硫基蛋白的正确折叠；周质空间中的蛋白酶要比胞内低很多，减少靶蛋白的降解；周质空间中的蛋白数量也较胞内少很多，利于靶蛋白的纯化。

(5) 表达菌株的选择，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。Rosetta2 系列补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的 tRNA（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC,GGA 及 CGG），提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平；K-12 衍生菌 Origami 2 系列，trxB 和 gor 双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性表达。Rosetta-gami™则是综合上述两类菌株的优点，既补充 7 种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。

(6) 诱导条件，培养条件对重组蛋白的表达也很关键的，例如温度，温度较高时蛋白表达量高但容易形成包涵体，而温度低时蛋白表达量低，但可以提高目的蛋白的可溶性；诱导物的浓度也同样影响重组蛋白的表达效率，如低浓度 IPTG 诱导可以提高可溶蛋白的含量。另外培养基的营养成分，pH 和其它参数都可以影响蛋白酶的活性，分泌和表达水平。

在大肠杆菌中表达外源蛋白，表达前的分析非常重要，对目的基因和蛋白进行具体分析，综合考虑，选择最适合的表达体系和方法，才能实现外源蛋白的高效表达。

编辑： weicf    来源：丁香园