实时荧光定量 PCR 引物设计原则

实时荧光定量 PCR（real-time PCR）技术和普通 PCR 相比，准确性和灵敏度高，速度快，效率高，近年来被广泛应用于医学、生物等各个领域，是进行分子生物学研究必不可少的技术工具。在科研方面可定量分析各种基因的的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态 SNP 测定及易位基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分析临床疾病早期诊断，病原体检测，耐药性分析，肿瘤微小残留病变研究，细胞因子的表达分析，病毒感染的定量检测等。

在整个荧光定量 PCR 实验设计中，引物的设计是实验成功的关键因素，很大程度决定了检测的灵敏度和准确性，一般 real-time PCR 引物的设计应遵循如下原则：

1. 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。

2. 扩增产物长度在 80-150bp。最长不要超过 300bp。

3. 产物不能形成二级结构（自由能小于 58.61KJ/mol）。

4. 引物长度：一般在 17-25 碱基之间，上下游引物不宜相差太大。引物长度是决定退火温度（Tm 值）最重要的因素。一般来讲，每增加一个核苷酸可使引物特异性提高 4 倍，但是由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

5. 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补，避免形成发卡结构。

6. 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补，避免形成引物二聚体。

7. 引物 G+C 含量在 40%～60% 之间，45-55％ 最好。引物中碱基要随机分布，尽量均匀，若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5』端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴来平衡一下。

8. 引物 Tm 值在 58-62 度之间，上下游引物 Tm 值不宜相差太大，最好不要超过 5 度。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，提高 PCR 的特异性；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使 DNA 双链结合。

9. 引物 5′端可以修饰；引物 5′端一般不会影响扩增的特异性，可进行修饰，如加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入突变位点、插入与缺失突变序列等。

10. 引物 3′端不可修饰，引物 3』端是延伸开始的地方，决定扩增的特异性。3』端应避开连续的 T/C,A/G（2-3 个）；也不能有形成任何二级结构。

11. 引物 3′端要避开密码子的第 3 位。因为密码子的兼并性，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

编辑： weicf    来源：丁香园